山楂釀酒酵母的篩選及其發(fā)酵性能測(cè)定

高清山，邢繼德，魏懷生，魯梅，燕淑海

（山東濰坊工程職業(yè)學(xué)院，山東青州262500）

山楂釀酒酵母的篩選及其發(fā)酵性能測(cè)定

高清山，邢繼德，魏懷生，魯梅，燕淑海

（山東濰坊工程職業(yè)學(xué)院，山東青州262500）

以山楂為原料,利用平板劃線分離法，得酵母9株。利用杜氏小管實(shí)驗(yàn)對(duì)酵母進(jìn)行篩選，獲得4株發(fā)酵力較強(qiáng)酵母。將其進(jìn)行酒精、酸度、糖度的耐受性試驗(yàn)，表明總體耐受性較好。將其與1450釀酒酵母共同進(jìn)行發(fā)酵性能測(cè)定，確定了⑤號(hào)酵母是優(yōu)良菌株。在60 mg/L SO2和28℃的條件下，可釀造出11.3（體積比）酒精度，3.0 g/L還原糖，8.1 g/L總酸度，0.21澄清度，酒色鮮紅、口感純正、香味濃郁的山楂干紅酒。

山楂；釀酒酵母；篩選；發(fā)酵特性

Abstract:In this paper,9 strains of yeast were obtained by using hawthorn as raw material and using streak plate as separation method.Initially screened with Du-canaliculus experiments four strains of yeast with stronger fermentation capability were identified.Further tolerance testing on alcohol contents,acidity and sugar contents indicates that their overall performance of fermentation is better.Applied jointly with Saccharomyces cerevisiae No.1450,the No.⑤strain of yeast is determined to have the fermentation performance of excellent yeast.Under the conditions of 60 mg/L SO2and 28℃,the yeast can produce a wine with the following characteristics:alcohol 11.3(V/v),reductionsugar3.0g/L,totalacidity8.1g/L,clarity0.21,bright-red incolor,puretaste,andrichfragrance.

Key words：hawthorn;Saccharomyces cerevisiae;screening;fermentation characteristics

山楂，又稱仙果，幾乎含有水果的所有營(yíng)養(yǎng)成分，18種氨基酸，特別是VC的含量較高，達(dá)到89 g，比蘋果高17倍，比梨高30倍。其主要成分有：山楂酸、黃酮、VC。主要功能：健胃消食、減肥、降血脂血壓、防衰老、增強(qiáng)肌體免疫力等。據(jù)《本草綱目》記載：山楂可消化飲食，消肉積癥瘕及痰飲痞滿吞酸、血瘀脹痛。據(jù)洪昭光《食物是最好的醫(yī)藥》介紹：山楂有很多的營(yíng)養(yǎng)和醫(yī)療價(jià)值，常吃山楂制品能開(kāi)胃消食，預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化，使人延年益壽，故山楂被人們視為“長(zhǎng)壽食品”。

山楂的品種很多，其中，以青州的敞口山楂最為有名。據(jù)青州府志記載，距今已有500多年的栽培歷史。敞口山楂果實(shí)扁圓形，果皮涂紅，果點(diǎn)黃白色，密集，果皮較粗糙，無(wú)光澤，因萼筒大而深，萼片開(kāi)張而成“敞口”。青州敞口山楂個(gè)大、質(zhì)優(yōu)，適于加工，抗逆性強(qiáng)，適應(yīng)范圍廣，全國(guó)各地慕名到青州引種及購(gòu)買者很多。近年來(lái)，由于深加工能力不足，青州山楂出現(xiàn)了相對(duì)的產(chǎn)大于銷的狀況，如何做好山楂果品的深加工，增加農(nóng)民收入，使山楂增產(chǎn)又增收，一直是果農(nóng)十分關(guān)注的問(wèn)題。根據(jù)當(dāng)前我國(guó)干紅果酒走俏市場(chǎng)的有利形勢(shì)，對(duì)山楂干紅生產(chǎn)的工藝條件進(jìn)行了探討，必將對(duì)當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)建設(shè)起到很好的推動(dòng)作用，提供一條解決“三農(nóng)”問(wèn)題的有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

青州山楂；白砂糖；麥芽；1450釀酒酵母。

1.2 儀器設(shè)備

SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱：上海將來(lái)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；手持糖度儀：上海暉創(chuàng)化學(xué)儀器有限公司；超凈工作臺(tái)；發(fā)酵管；GC7890F氣相色譜儀：安捷倫科技有限公司；722S分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；全果榨汁機(jī)；殺菌設(shè)備；天平；顯微鏡等。

1.3 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：葡萄糖 5%，（NH4）2SO40.2%，KH2PO40.25%，MgSO4·7H2O 0.1%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01%，酵母膏0.05%，上述材料滅菌后加亞硫酸鈉至30 mg/L。

分離培養(yǎng)基：酵母膏3 g，蛋白胨5 g，麥芽汁3 g，葡萄糖8 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，121℃蒸汽滅菌20 min，pH自然。

麥芽汁發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖20%，酵母膏1%，麥芽汁3g，（NH4）2SO40.1%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O0.1%。

山楂汁發(fā)酵培養(yǎng)基：取山楂汁，稀釋調(diào)整成分，加入使發(fā)酵后生成15%（體積比）酒的白砂糖，加亞硫酸鈉至 30 mg/L，調(diào)pH3.5。

1.4 方法

1.4.1 山楂酒酵母的富集培養(yǎng)以及初步分離純化[1-3]

將成熟山楂搗碎放于無(wú)菌的三角瓶中，暴露于空氣中自然發(fā)酵，當(dāng)有氣泡產(chǎn)生并聞之有酒味時(shí)，用無(wú)菌紗布過(guò)濾，取過(guò)濾果汁50 mL加入富集培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)2 d～3 d，得到增殖培養(yǎng)液。將富集培養(yǎng)好的菌種通過(guò)初步分離純化得到單菌落。選取較大菌落，編號(hào)后分別接入富集培養(yǎng)基試管斜面上，28℃培養(yǎng)2 d～3 d，置于4℃冰箱中保存待用。

1.4.2 優(yōu)良山楂酒酵母篩選試驗(yàn)[4-6]

1.4.2.1 山楂酒酵母的初篩

杜氏管發(fā)酵實(shí)驗(yàn)法：將活化傳代的酵母接人帶有杜氏管的麥芽汁（10°Brix）培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)48 h，接種量為1.0×107cfu/mL。

1.4.2.2 酵母耐性實(shí)驗(yàn)

將菌種分別采用不同的乙醇濃度（4%、8%、12%、16%、20%）、pH（1.5、2.5、3.5、4.5、5.5）以及糖濃度（10%、20%、30%、40%、50%)的帶有杜氏管的麥芽汁發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)3 d，選擇產(chǎn)氣好的菌株。接種量為1.0×107cfu/mL。

1.4.3 山楂酒酵母的復(fù)篩[7-9]

將初篩得到的耐性較好的酵母株接人山楂汁發(fā)酵培養(yǎng)基，將活化1450釀酒酵母后，作同條件對(duì)照試驗(yàn)。

檢測(cè)方法：酒精度（以體積百分?jǐn)?shù)計(jì)，%vol）采用氣象色譜法；殘還原糖（g/L）采用斐林法；酸度采用酸堿滴定法；澄清度采用分光光度計(jì)測(cè)定。

2 結(jié)果和分析

2.1 酵母菌株的分離[10-12]

富集培養(yǎng)后，經(jīng)稀釋以及劃線分離后挑出具有典型酵母菌落特征的菌株,用顯微鏡觀察形態(tài)特征，并經(jīng)酵母生理生化特性鑒定為酵母的共9株。

2.2 杜氏管發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

分離得到的9株酵母分別編號(hào)，進(jìn)行杜氏管產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)5 d后結(jié)果如表1。

表1 杜氏管實(shí)驗(yàn)Table 1 Experiment of Du-canaliculus

由表1可知，發(fā)酵24 h，有大量氣泡產(chǎn)生的菌株有1株（酵母⑤號(hào)），48 h發(fā)酵有大量氣泡產(chǎn)生的菌株有3株（酵母①號(hào)、③號(hào)、⑧號(hào)），這4株菌都有酒香生成，保留這4株進(jìn)行下一步篩選實(shí)驗(yàn)。

2.3 酵母耐受性實(shí)驗(yàn)

2.3.1 酵母耐乙醇能力測(cè)定[13]

山楂酒在發(fā)酵過(guò)程，隨酒度不斷增加，在糖度還沒(méi)有下降到足夠低的時(shí)候，高濃度的酒精會(huì)抑制酵母的發(fā)酵；或者由于外因的影響，發(fā)酵醪突然中止發(fā)酵的情況下，必須添加處理好的山楂汁重新啟動(dòng)發(fā)酵。因此，在這些情況下，酵母對(duì)較高酒精濃度發(fā)酵液的適應(yīng)能力顯得非常重要，表2為各種酵母在不同酒精濃度條件下的耐受情況。

表2 不同酵母的耐乙醇性結(jié)果Table 2 Alcohol tolerance results of different strains of yeast

由表2可以看出：4株酵母在12%的酒精度環(huán)境中，耐受性均較好，隨著酒精度的提高，酵母⑧號(hào)對(duì)較高濃度酒精的耐受性大大降低，其余3株耐受性較好。

2.3.2 酵母耐酸堿度測(cè)定[14]

山楂汁的酸性比較大，一方面可抑制有害菌的生長(zhǎng)，避免發(fā)酵期間有害菌的感染，另一方面要求生產(chǎn)菌種必須具有較好的耐酸性能。因此在山楂酒酵母選育中，進(jìn)行酵母的耐酸性測(cè)試非常重要，表3為不同pH下的酵母發(fā)酵情況。

表3 不同酵母的耐酸性的測(cè)試結(jié)果Table 3 Acidity tolerance results of different strains of yeast

由表3中可以看出：4株酵母在pH為3.5的環(huán)境中，耐受酸性均較好，在較低的pH下，酵母①號(hào)和酵母⑧號(hào)菌的耐受性明顯減弱，酵母⑧號(hào)菌尤為明顯。

2.3.3 酵母耐糖度測(cè)定[15-16]

在釀造山楂酒過(guò)程中，為了得到較高的酒精度，便于酒的保藏，需要調(diào)整加入更多的蔗糖，而糖濃度的增加對(duì)酵母滲透性可能產(chǎn)生影響，因此，要對(duì)篩選菌株進(jìn)行耐糖度測(cè)試，表4為不同糖度下的酵母發(fā)酵情況。

表4 不同酵母在不同糖度下的充盈用時(shí)Table 4 Results different yeast in different sugar degree of fillingtime

由表4可以看出：4株酵母在20%左右的糖濃度環(huán)境中，發(fā)酵性能較好。但是，糖濃度降低，杜氏小管充盈時(shí)間延長(zhǎng)；糖濃度提高，對(duì)酵母的抑制作用增強(qiáng)；當(dāng)糖濃度達(dá)到50%時(shí)，①號(hào)和③號(hào)酵母明顯受到抑制，幾乎喪失發(fā)酵功能；⑤號(hào)酵母的耐糖度性最好，⑧號(hào)酵母次之。

2.4 酵母發(fā)酵性能的測(cè)定[11-13]

選取成熟無(wú)霉變的山楂，去梗洗凈，稱量后去核打漿，稀釋后，加入一倍體積量的4%的脫臭酒精軟化水和10 mg/L的亞硫酸鈉，根據(jù)17.5 g/L的糖可生成1度酒精的比例再加入使發(fā)酵后生成12%（體積比）酒精度的白砂糖，加亞硫酸鈉至30 mg/L，調(diào)pH 3.5。將初篩得到的4株酵母、活化1450釀酒酵母分別以8%的接種量接人山楂汁發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃靜止發(fā)酵5 d后，測(cè)定酒精度、還原糖、總酸度、澄清度，表5為測(cè)定情況。

表5 不同酵母發(fā)酵性能測(cè)定情況Table 5 Fermentation performance measurement results of different strains of yeast

由表5可以看出：⑤和③號(hào)酵母產(chǎn)酒精量分別為11.3和10.2（28℃、體積比），說(shuō)明此2菌株產(chǎn)酒精能力最好；1450釀酒酵母和⑤號(hào)酵母對(duì)還原糖的利用能力最好；各項(xiàng)指標(biāo)綜合顯示：⑤號(hào)酵母酒體澄清度最好，酸度最低，口感好，香味重，是一優(yōu)良菌株，可以用于山楂酒生產(chǎn)，各項(xiàng)指標(biāo)顯示性能優(yōu)于1450釀酒酵母，命名為山楂一號(hào)酵母。

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，自然發(fā)酵山楂是分離篩選山楂酒酵母的良好材料，經(jīng)過(guò)分離、初篩、復(fù)篩和發(fā)酵性能測(cè)定，山楂一號(hào)酵母在相同條件下起酵時(shí)間為最短的13 h，在4%~20%酒精環(huán)境中有很好的耐受性，最佳耐受糖度為30%左右，最適pH為3.5左右，在60 mg/L SO2和28℃的條件下，可釀造出11.3（體積比）酒精度，3.0 g/L還原糖，8.1 g/L總酸度，口感純正、香味濃郁的山楂干紅酒，證明山楂一號(hào)酵母適合釀造山楂干紅酒。

本試驗(yàn)僅報(bào)道了山楂一號(hào)的分離篩選及初步測(cè)定，但對(duì)其菌種的生理生化特性、培養(yǎng)特征、16SrDNA序列分析、以及形態(tài)特征、表面結(jié)構(gòu)和生化測(cè)定、細(xì)胞壁的成分分析尚未研究。另外，利用山楂一號(hào)酵母，對(duì)山楂干紅生產(chǎn)工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，找出適合當(dāng)?shù)厣介杉t生產(chǎn)的最佳工藝尚需進(jìn)一步研究[15-18]。

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Screening of Hawthorn Saccharomyces Cerevisiae and Measurements of Their Fermentation Performance

GAO Qing-shan,XING Ji-de,WEI Huai-sheng,LU Mei,YAN Shu-hai
（Weifang Engineering Vocational College,Qingzhou 262500,Shandong,China）

2011-11-26

山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃項(xiàng)目（J10LC77）

高清山（1968—），男（漢），講師，本科，碩士，主要從事應(yīng)用微生物研究。