木糖母液發(fā)酵生產2，3-丁二醇的研究

汪東升，張翠英，彭曉培，周磊，肖冬光

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津300457）

木糖母液發(fā)酵生產2，3-丁二醇的研究

汪東升，張翠英，彭曉培，周磊，肖冬光*

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津300457）

對4株2，3-丁二醇生產菌株利用木糖的能力進行比較，其中肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae CICC 10011）具有最佳的發(fā)酵性能，并以該菌為出發(fā)菌株對其利用木糖母液發(fā)酵2，3-丁二醇進行研究。首先通過單因素試驗研究木糖母液和氮源對2，3-丁二醇發(fā)酵的影響，然后采用L9（34）正交試驗優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分，優(yōu)化后的培養(yǎng)基組分為，木糖母液 90g/L，玉米漿 12g/L，K2HPO47g/L，KH2PO42 g/L，（NH4）2SO42 g/L，檸檬酸鈉 3 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，FeSO4·7H2O 0.005 g/L，MnSO4·7H2O 0.005 g/L，ZnSO4·7H2O 0.01 g/L。在優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵，72 h發(fā)酵2，3-丁二醇濃度為35.7 g/L，比優(yōu)化前增加了7.5 g/L，2，3-丁二醇得率達到了理論得率的92%。

菌種篩選；木糖母液；2，3－丁二醇；培養(yǎng)基優(yōu)化

Abstract:Four 2,3-butanediol producing strains were compared to utilize xylose,in which Klebsiella pneumoniae CICC 10011 was the best,with which as the starting strain xylose mother liquor was used to produce 2,3-butanediol.Firstly,single-factor experiments were carried out to study the effects of xylose mother liquor and nitrogen source.The fermentation medium was then optimized by orthogonal design.The optimized composition was as follows:xylose mother liquor 90 g/L，CSLP 12 g/L，K2HPO47 g/L，KH2PO42 g/L，(NH4)2SO42 g/L,sodium citrate 3 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L,FeSO4·7H2O 0.005 g/L,MnSO4·7H2O 0.005 g/L,ZnSO4·7H2O 0.01 g/L.Under above conditions,final concentration of 2,3-butanediol reached 35.7 g/L,7.5 g/L higher than that under the initial conditions,the yield was 92%of the theory.

Key words：strain screening;xylose mother liquor;2,3-butanediol;medium optimization

2，3-丁二醇是一種無色無味的手性化合物，存在3 種旋光異構體，分別為 D－（－）－2，3-丁二醇，L－（＋）-2，3-丁二醇和 meso-2，3-丁二醇[1-2]。作為一種大宗化學品，廣泛應用于化工、食品、醫(yī)藥、燃料以及航空航天等多個領域。目前，利用微生物發(fā)酵生產2，3-丁二醇已經獲得廣泛的研究，其常見原料為淀粉水解液、糖蜜、乳清等[3-4]，成本較高。其中木質纖維原料含糖量豐富，來源廣泛，成本較低，經過化學和生物的處理可以用以生產2，3-丁二醇。玉米芯作為一種木質纖維素原料，在我國有廣泛的來源。木糖母液是以玉米芯為原料生產木糖醇工業(yè)中的副產物，混合糖含量高，主要成分是木糖，還有少量的阿拉伯糖和葡萄糖[5]。目前利用木糖母液生產2，3-丁二醇的研究還處于起步階段，鮮見有關利用木糖母液生產2，3-丁二醇的報道。本文比較4株常見的2，3-丁二醇生產菌利用木糖生產2，3-丁二醇的能力，篩選出適合木糖母液發(fā)酵的菌種，并對其發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae CICC10011），產酸克雷伯氏菌（KlebsiellaoxytocaCICC21518），產酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca CICC 22913），多黏芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa CICC 10010）均購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 20；蛋白胨 10；酵母粉5；氯化鈉 10；瓊脂 2。種子培養(yǎng)基（g/L）：木糖 20；蛋白胨10；酵母粉5；氯化鈉10。初始發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：木糖 80，酵母粉 20，K2HPO45，KH2PO42，（NH4）2SO42，檸檬酸鈉 3，MgSO4·7H2O 0.1，FeSO4·7H2O 0.005，MnSO4·7H2O 0.005，ZnSO4·7H2O 0.01。優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：木糖母液 90，玉米漿 12，K2HPO47，KH2PO42，（NH4）2SO42，檸檬酸鈉3，微量元素濃度與初始發(fā)酵培養(yǎng)基相同。

培養(yǎng)基一律115℃滅菌20 min，發(fā)酵培養(yǎng)基中木糖和木糖母液單滅。

1.2 方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

接一環(huán)生長良好的斜面菌接入裝有100 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，置于轉速為200 r/min的搖床上，37℃培養(yǎng)12 h。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)

按體積比5%的接種量將種子液接種到裝液量為100 mL液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，初始pH 6.0，置于35℃恒溫搖床上發(fā)酵，搖床轉速120 r/min，發(fā)酵時間72 h。

1.2.3 分析方法

總糖濃度的測定：DNS法[6]。

木糖、葡萄糖、阿拉伯糖濃度的測定：高效液相色譜法。色譜條件為：色譜柱型號Aminex HPX-87H柱（Bio-Rad美國），柱溫65℃，流動相0.005 mol/L H2SO4，流速為0.6 mL/min。示差檢測器檢測，進樣量20 μL。

2，3-丁二醇濃度的測定：見文獻[7]。

2 結果與討論

2.1 出發(fā)菌株的選擇

一般來說，肺炎克雷伯氏菌、產酸克雷伯氏菌和多粘芽孢桿菌都是發(fā)酵生產2，3-丁二醇的常見菌種[8-9]。從上述菌種中挑選了4株菌種，以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎，考察4株菌利用木糖發(fā)酵生產2，3-丁二醇的情況，結果見表1。

由表1的結果可知，4株菌利用木糖的能力各有不同，2株產酸克雷伯氏菌利用木糖母液生產2，3-丁二醇的能力都較差，2，3-丁二醇濃度和得率都不高；多黏芽孢桿菌利用木糖的能力最差，2，3-丁二醇濃度只有12.7g/L；肺炎克雷伯氏菌CICC10011利用木糖的能力最好，最終2，3-丁二醇濃度和得率分別為28.2g/L、0.39 g/g，糖利用率達到90.0%，因此選定肺炎克雷伯氏菌CICC10011為利用木糖母液發(fā)酵生產2，3-丁二醇的出發(fā)菌株。

表1 4種不同菌株利用木糖的發(fā)酵結果Table 1 Fermentation results of 4 different strains using xylose

2.2 木糖母液濃度對2，3-丁二醇發(fā)酵的影響

木糖母液中主要成分是木糖，還含有少量的葡萄糖和阿拉伯糖。一般來說較高的糖濃度對菌種發(fā)酵有抑制作用，從工廠直接得到的木糖母液，其混合糖濃度大約為600 g/L，其中木糖濃度400 g/L，葡萄糖和阿拉伯糖濃度大致相等為65 g/L，不適合直接進行發(fā)酵利用。根據相關文獻報道[10-11]，選定初始木糖母液濃度分別為 60、80、100、120 g/L，發(fā)酵不同時間，考察木糖母液濃度對發(fā)酵的影響，結果見表2。

表2 木糖母液濃度對發(fā)酵的影響Table 2 Effect of xylose mother liquor on the production of 2，3-butanediol

從表2可以看出，當初始木糖母液濃度為60g/L時，木糖利用率是最高的，達到92.7%，可其2，3-丁二醇得率較低為0.36，說明底物濃度較低時有利于底物的利用，但其經濟效益不高。木糖母液濃度濃度為80 g/L時，2，3-丁二醇得率最高為0.39，當木糖母液濃度超過100 g/L時，2，3-丁二醇濃度雖然還在升高，但木糖母液利用率和2，3-丁二醇得率開始下降，說明底物濃度太高會抑制2，3-丁二醇的發(fā)酵，因此選擇初始木糖母液濃度為80 g/L。

2.3 氮源對2，3-丁二醇發(fā)酵的影響

2.3.1 不同氮源對2，3-丁二醇發(fā)酵的影響

初始發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源為酵母粉，酵母粉是常用的氮源和生長因子的來源。可是酵母粉價格昂貴，并不適合工業(yè)生產，因而需要選擇一種既高效又低廉的氮源來代替酵母粉?？刂瞥跏嫉礉舛葹?0 g/L，分別以酵母粉、蛋白胨、玉米漿、硫酸銨、尿素、氯化銨為氮源，考察不同氮源對木糖母液利用和2，3-丁二醇生成的影響，結果如圖1所示。

由圖1可知，玉米漿、蛋白胨、酵母粉作為氮源時，木糖利用率和2，3-丁二醇得率都明顯優(yōu)于無機氮源，其可能的原因是有機氮源營養(yǎng)成分較多，含有能促進微生物生長的維生素、氨基酸和微量元素等。當以玉米漿和蛋白胨作為氮源時，木糖利用率和2，3-丁二醇得率要高于酵母粉，說明玉米漿和蛋白胨更利于2，3-丁二醇的發(fā)酵，玉米漿比蛋白胨成本更低，因此選擇玉米漿為最適合的氮源。

2.3.2 玉米漿濃度對2，3-丁二醇發(fā)酵的影響

玉米漿是玉米濕法研磨的主要副產物，含氮量超過了40%，其中含有豐富的可溶性蛋白、生長素和一些前體物質，其廣泛用于發(fā)酵工業(yè)。本試驗在木糖母液濃度為80 g/L時，考察不同玉米漿濃度對2，3-丁二醇發(fā)酵的影響，結果見表3。

表3 玉米漿對2，3-丁二醇發(fā)酵的影響Table 3 Effect of corn liquor on the production of 2，3-butanediol

由表3結果可知，隨著玉米漿濃度的增加，殘?zhí)菨舛仍诮档?，木糖母液利用率增加，可見隨著氮源濃度的增加糖的利用也在加快。2，3-丁二醇產量也隨著玉米漿濃度的變化呈現先增加后降低的趨勢，當玉米漿濃度為12 g/L時，2，3-丁二醇濃度和得率達到最大，分別為32.1 g/L和0.43 g/g。玉米漿濃度超過12 g/L后，木糖母液利用率繼續(xù)升高，2，3-丁二醇濃度卻開始下降，可能的原因是氮源濃度過導致菌種以生產生物量增多，代謝產物2，3-丁二醇的生成減弱，因此選擇12 g/L為玉米漿的最適濃度。

2.4 正交試驗優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基中磷酸氫二鉀和檸檬酸鈉對2，3-丁二醇發(fā)酵也有重要的影響，Ma等[8]通過Plackett-Burman設計確定了玉米漿和磷酸氫二銨為顯著因素。李元芳等[9]發(fā)現在培養(yǎng)基中添加檸檬酸不僅促進細胞生長與糖消耗速度，還可以縮短發(fā)酵周期，提高2，3-丁二醇產量。因此我們在前面單因素試驗的基礎上，設計L9（34）正交試驗，考察木糖母液、玉米漿、磷酸氫二鉀和檸檬酸鈉這4種因素對發(fā)酵影響的顯著程度，正交因素水平表見表4。

表4 正交試驗因素水平表Table 4 The levels of factors table of orthogonal experiment

正交試驗結果和各因素效應圖如表5和圖2所示，各因素對發(fā)酵影響的大小順序為木糖母液＞玉米漿＞磷酸氫二鉀＞檸檬酸鈉，最終確定的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：木糖母液90g/L，玉米漿12g/L，磷酸氫二鉀7g/L，檸檬酸鈉3 g/L。

表5 正交試驗結果及極差分析Table 5 Results and analysis of range of orthogonal experiment

2.5 最優(yōu)培養(yǎng)基驗證

按照優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基組成發(fā)酵生產2，3-丁二醇，共進行3組平行，發(fā)酵72 h，2，3-丁二醇濃度達到了35.7 g/L，比優(yōu)化前增加了7.5 g/L，木糖母液利用率為87%，2，3-丁二醇得率為0.46 g/g。

3 結論

本實驗中4株2，3-丁二醇生產菌株都具有利用木糖的能力，但是性能各異，其中Klebsiella pneumoniae CICC 10011是最優(yōu)的發(fā)酵菌株，以木糖母液為底物通過單因素試驗和正交設計優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基，以優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵，2，3-丁二醇濃度達到了35.7 g/L，2，3-丁二醇得率為理論得率的92%。

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2,3-Butanediol Production Using Xylose Mother Liquor

WANG Dong-sheng,ZHANG Cui-ying,PENG Xiao-pei,ZHOU Lei,XIAO Dong-guang*
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology,Ministry of Education,College of Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China）

2011-12-07

汪東升（1987—），男（漢），在讀碩士研究生，研究方向：現代釀造技術。

*通信作者：肖冬光，教授。