響應(yīng)面法和正交試驗對骨素酶解工藝優(yōu)化的比較

張崟，王衛(wèi)，張佳敏，蒲登順

（成都大學(xué)四川省肉類加工重點實驗室，四川成都610106）

響應(yīng)面法和正交試驗對骨素酶解工藝優(yōu)化的比較

張崟，王衛(wèi)，張佳敏，蒲登順

（成都大學(xué)四川省肉類加工重點實驗室，四川成都610106）

探討酶解骨素的最優(yōu)工藝及對優(yōu)化實驗方法的選擇提供借鑒，通過響應(yīng)面法和正交試驗分析了酶解骨素的最優(yōu)工藝，并對結(jié)果進行比較，發(fā)現(xiàn)兩種試驗設(shè)計方法在分析各因素對水解度的影響上得出的結(jié)果相同，即酶濃度>時間>溫度>pH，但是響應(yīng)面法對數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析優(yōu)于正交試驗；兩種方法獲得的最優(yōu)工藝驗證實驗顯示，響應(yīng)面法得出的最優(yōu)工藝所得的水解度比正交試驗高出15.4%。酶解骨素的最優(yōu)工藝確定以響應(yīng)面法為準(zhǔn)，為酶解溫度60℃、酶解時間 5 h、pH 4、酶用量 0.146 mkat/g。

正交試驗；響應(yīng)面；骨素；酶解

Abstract:The optimal hydrolysis processing for bone extract was investigated by two methods(orthogonal design experiment and response surface design experiment);and the obtained optimal hydrolysis processing from the two methods were compared.The results indicated that the two methods obtained the same results when they were used to analyze the effect of single factors on hydrolysis rate,namely,concentration of enzyme>time>temperature>pH,but the response surface method showed a better analysis than that of the orthogonal method.Verification testing results indicated that the hydrolysis rate,from the optimal processing of response surface method,was 15.4%higher than that of orthogonal method.The optimal processing was decided according to response surface method,and the optimal processing was temperature 60℃,time 5 h,pH 4,the addition amount of papaya protease 0.146 mkat/g.

Key words：orthogonal design experiment;response surface;bone extract;hydrolysis

酶解技術(shù)以其溫和的反應(yīng)條件和高效的催化作用而在畜禽骨利用中廣泛應(yīng)用。由于酶解時涉及的影響因素比較多，所以采取適當(dāng)?shù)膶嶒灧椒▽Ω饕蛩剡M行優(yōu)化以獲得最佳酶解工藝非常必要。在進行優(yōu)化實驗時，正交試驗或響應(yīng)面法是常用的實驗設(shè)計方法，如在酶解利用雞骨[1]、雞骨泥[2]、骨膠原蛋白中用響應(yīng)面法獲得最佳的酶解條件[3]；在酶解利用新鮮豬骨[4]、雞骨[5]、羊骨中用正交實驗獲得最優(yōu)的酶解工藝條件[6]等。

響應(yīng)面法是由Box和Wilson在1950年最早提出來的用于獲得最優(yōu)實驗條件的方法，在化學(xué)和化學(xué)工程領(lǐng)域都有成功的應(yīng)用[7-8]。正交試驗又稱正交拉丁方試驗，是以拉丁方的正交性為依據(jù)，從全面試驗中挑選出部分有代表性的點進行試驗，以獲得最優(yōu)的因素組合和最佳實驗結(jié)果，是一種高效率、快速、經(jīng)濟的實驗設(shè)計方法[9]。如今，這兩種實驗設(shè)計方法已在食品工業(yè)有廣泛的應(yīng)用。

目前，國內(nèi)外對這兩種優(yōu)化實驗設(shè)計方法的優(yōu)化效果優(yōu)劣的對比較少，這容易導(dǎo)致選擇優(yōu)化實驗方法時的盲目性。因此，為了探討酶解骨素的最優(yōu)工藝和對優(yōu)化實驗方法的選擇提供借鑒，本文將這兩種優(yōu)化實驗方法同時應(yīng)用于骨素酶解條件的優(yōu)化，以探討這兩種優(yōu)化實驗設(shè)計方法應(yīng)用效果的差別。

1 材料和方法

1.1 材料

木瓜蛋白酶購于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，酶活力8.35 mkat/g；檸檬酸與磷酸氫二鈉、甲醛均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 骨素提取

將清洗干凈的豬骨頭，經(jīng)PG-150破碎機（廊坊冠通機械有限公司）破碎成塊，然后加入到提取罐進行高溫高壓（0.1 MPa，121℃）煮4 h，將提取液過濾、靜置后采用SO-97油水分離機（上海征富機械有限公司）分離得到骨素。

1.2.2 酶解條件

固定料液比為1∶10（g/mL）。調(diào)節(jié)pH后加入一定量木瓜蛋白酶，置于DZKW-4水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）酶解不同時間。酶解后取上清液5 mL，用TGL-16G離心機在4000 r/min下離心5 min，所得上清液用于檢測分析。

1.2.3 水解度計算

水解度是指酶解液中游離氨基態(tài)氮的含量占總氮量的百分比。游離氨基態(tài)氮采用甲醛電位滴定法測定[10]。水解度計算式如下：

水解度/%=酶解液氨基氮/酶解體系總氮×100

1.2.4 響應(yīng)面設(shè)計

采用4因素、7中心、4響應(yīng)、31次實驗的中心旋轉(zhuǎn)設(shè)計，對木瓜蛋白酶酶解工藝條件進行分析和優(yōu)化。酶解條件的限值選擇根據(jù)文獻[11]。因素編碼及因素水平見表1。

表1 因素編碼及因素水平Table 1 Coded levels of experiment factor for response surfacedesign

1.2.5 正交試驗設(shè)計

以溫度 40℃～60℃、加酶量 0.084 mkat/g～0.167 mkat/g、時間 2 h～5 h、pH 4～6 為各因素的變化范圍[11]，選擇L9（34）正交表設(shè)計正交試驗。正交試驗因素及水平見表2。

表2 正交試驗因素及水平Table 2 Levels of experiment factor for orthogonal design

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

采用SAS9.0進行響應(yīng)面設(shè)計及數(shù)據(jù)分析，其余數(shù)據(jù)利用Excel 2003進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 響應(yīng)面法優(yōu)化酶解骨素工藝

2.1.1 酶解條件擬合

響應(yīng)面實驗方案及試驗結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面實驗方案及試驗結(jié)果Table 3 Response surface program and experiment results

以水解度為因變量，酶解溫度、酶解時間、pH及加酶量為自變量，對實驗結(jié)果進行擬合，所得主擬合模型的顯著性分析見表4，單因素對水解度的影響分析見表5。

表4 數(shù)學(xué)模型的顯著性分析Table 4 Significant analysis of relativity model

表5 單因素對水解度的影響分析Table 5 Significant analysis of signal factors

表4中p值顯示，水解度與酶解溫度、酶解時間、pH及加酶量之間存在顯著（P=0.026<0.05）相關(guān)性；擬合模型中一次項對水解度有顯著影響（P<0.05）；擬合模型中二次項對水解度的影響不顯著（P＞0.05）。

表5中p值顯示，溫度、時間和加酶量的p值均小于0.05，說明溫度、時間和加酶量對水解度的影響顯著；而pH的p值大于0.05，說明pH對水解度的影響不顯著。比較各因素的p值，可知p加酶量>p酶解時間>p酶解溫度>ppH，因此，各單因素對水解度的影響程度大小依次為酶濃度>時間>溫度>pH，即酶濃度對水解度的影響最大，其次為酶解時間和溫度，pH對水解度無顯著影響。

2.1.2 酶解工藝條件優(yōu)化

在建立酶解條件與水解度的數(shù)學(xué)模型基礎(chǔ)上，對實驗結(jié)果進行優(yōu)化。以水解度為最大值，酶解溫度、酶解時間、pH及加酶量的極值為評判參考，分析最優(yōu)工藝，優(yōu)化結(jié)果的響應(yīng)面見圖1。

由圖1可知，得出溫度60℃、時間5h、pH4、酶用量0.146mkat/g時骨素的水解度最高。由此可知，酶解溫度60℃、酶解時間5 h、pH 4、酶用量0.146 mkat/g時，酶解效果最好。

2.2 正交試驗優(yōu)化酶解骨素工藝

根據(jù)單因素試驗確定的酶解溫度、酶解時間、pH值及酶濃度[11]，利用L9（34）正交表建立的正交試驗方案及實驗結(jié)果見表6。

表6 L9（34）正交試驗方案及結(jié)果分析Table 6 L9(34)Orthogonal design and experiment results analysis

續(xù)表6 L9（34）正交試驗方案及結(jié)果分析Continue table 6 L9(34)Orthogonal design and experiment results analysis

對表6中的水解度進行統(tǒng)計分析，所得K值及R值見表6，K值及R值分布見圖2，圖3。

由表6中的K值及圖2可知，溫度60℃、時間5h、pH 4、酶濃度0.167 mkat/g時水解度最高。因此，酶解骨素的最優(yōu)工藝為溫度60℃、時間5 h、pH 4、酶濃度0.167 mkat/g。

由表6中R值及圖3中R值分布可知，各因素對水解度的影響程度由大到小依次為酶濃度>時間>溫度>pH，即酶濃度對水解度的影響最大，其次為酶解時間和溫度，pH對水解度的影響最小。

2.3 響應(yīng)面分析與正交試驗驗證比較

2.3.1 影響因素分析

比較正交試驗及響應(yīng)面法所得的各因素對水解度的影響程度分析，得出兩者的分析結(jié)果是相同的，即酶濃度>時間>溫度>pH，但是正交試驗對數(shù)據(jù)的分析不僅信息量少，而且未能體現(xiàn)各因素對水解度是否有顯著性影響，而響應(yīng)面法對數(shù)據(jù)的分析比較詳細，不僅可以知道各因素對水解度的影響大小，而且可以知道各因素是否對水解度有顯著性影響。因此，響應(yīng)面法與正交試驗相比，在對各因素對水解度影響程度及顯著性的分析上優(yōu)于正交試驗。

2.3.2 優(yōu)化工藝驗證

通過正交試驗和響應(yīng)面得到的最優(yōu)工藝見表7。分別以表7中的酶解條件為反應(yīng)條件，做驗證試驗，所得水解度見表7。

表7 最優(yōu)工藝數(shù)據(jù)對比驗證Table 7 Comparison of verification test results

表7中水解度顯示，用響應(yīng)面法和正交試驗求出的優(yōu)化參數(shù)獲得的水解度分別為1.613%和1.398%，可見用響應(yīng)面優(yōu)化參數(shù)獲得的水解度明顯高于正交試驗，而且比正交試驗高出15.4%。

3 結(jié)論

通過比較響應(yīng)面法和正交試驗對酶解骨素條件的優(yōu)化結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩種試驗設(shè)計方法在分析各因素對水解度的影響上得出的結(jié)果相同，即酶濃度>時間>溫度>pH，但是響應(yīng)面法對數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析優(yōu)于正交試驗；兩種方法獲得的最優(yōu)工藝的驗證實驗數(shù)據(jù)顯示，響應(yīng)面法得出的最優(yōu)工藝獲得的水解度比正交試驗高出15.4%。總之，在酶解骨素工藝的優(yōu)化上，響應(yīng)面法優(yōu)于正交試驗。酶解骨素最優(yōu)工藝的確定以響應(yīng)面法為準(zhǔn)，最終確定為酶解溫度60℃、酶解時間5 h、pH 4、酶用量0.146 mkat/g。

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Comparison of the Optimized Hydrolysis Processing for Bone Extract Obtain by Orthogonal and Response Surface Design Experiments

ZHANG Yin,WANG Wei,ZHANG Jia-min,PU Deng-shun
（Sichuan Province Key Laboratory of Meat Processing，Chengdu University,Chengdu 610106,Sichuan,China）

2011-11-11

張崟（1981—），男（漢），副教授，研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與保藏。