紫外分光光度法測定柑橘皮中的總黃酮

徐旭耀，蕭許鳳，梅丹丹，余炳生

（湛江師范學院化學科學與技術(shù)學院，廣東高校新材料工程技術(shù)開發(fā)中心，廣東湛江524048）

紫外分光光度法測定柑橘皮中的總黃酮

徐旭耀，蕭許鳳，梅丹丹，余炳生*

（湛江師范學院化學科學與技術(shù)學院，廣東高校新材料工程技術(shù)開發(fā)中心，廣東湛江524048）

以蘆丁為對照品，271 nm為檢測波長，采用紫外分光光度法測定柑橘皮中總黃酮的含量。蘆丁對照品在6.2 μg/mL~56 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r＝0.9993）。利用均勻設(shè)計法，以功率、時間、乙醇濃度、料液比等為考察因素，研究并比較超聲波和微波提取柑橘皮中總黃酮的條件，發(fā)現(xiàn)在所用的實驗條件下微波法的總提取率高于超聲波法。微波法的較優(yōu)提取條件為：功率60%，時間7 min，乙醇濃度50%，料液比1∶45（g/mL）。因此，試驗選用微波法作為柑橘皮中總黃酮的提取方法。方法的平均加標回收率為99.5%，并用于柑橘皮中總黃酮的測定，取得了較滿意的結(jié)果。

超聲波；微波；柑橘皮；總黃酮；紫外分光光度法；均勻設(shè)計法

Abstract:Total flavonoid in citrus peels was determined by UV spectrophotometry at 271 nm using rutin as the standard compound.The calibration curve was linear in the range of 6.2 μg/mL-56 μg/mL for rutin(r=0.9993).The extraction conditions of total flavonoid from citrus peels were compared by ultrasonic and microwaveassistance with the uniform design method,with respects of power,extracting time,ethanol concentration,ratio of solid to liquid as the investigated factors,and it was found that the microwave extraction rate was higher than ultrasound-assisted extraction rate in the tested experimental conditions.The chosen extraction condition of microwave method was as follows:microwave power 60%,extracting time 7 minutes,50%ethanol,and ratio of solid to liquid 1∶45(g/mL).Therefore,microwave method was selected as the extraction method of total flavonoid measurement by UV spectrometry in citrus peels.The average recovery of the methods was 99.5%,and the method was satisfactorily used in determination of total flavonoids in citrus peels.

Key words：ultrasound;microwave;citrus peels;total flavonoids;UV spectrophotometry;the uniform design method

柑橘為蕓香科柑橘屬，原產(chǎn)于我國，全世界有80多個國家栽培柑橘，其產(chǎn)量居水果之首。柑橘皮中含有豐富的黃酮類物質(zhì)成分，它們具有抗氧化、抗癌、防止心血管疾病、消炎、抗過敏、鎮(zhèn)痛、抗菌和抗病毒等作用[1-5]。因此，測定其中黃酮的含量具有重要的現(xiàn)實意義。

黃酮類化合物常見的測定方法有HPLC法[6-7]，分光光度法[8]，比色法[9]和近紅外反射光譜法[10]等。對總黃酮含量的測定，多采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH體系分光光度法，在510 nm下測定其吸光度，但操作比較煩瑣，用時較長，體系相對復雜[11]。蘇東林[12]等認為，以氯化鋁顯色法（275 nm）結(jié)果比較準確，并經(jīng)過HPLC法檢驗，而直接測定法（270 nm）結(jié)果次之，硝酸鋁顯色法（345 nm）結(jié)果相對稍差。

黃酮的提取是測定的關(guān)鍵因素之一，也是黃酮生產(chǎn)的主要環(huán)節(jié)。因此，研究黃酮的提取具有多方面的重要性。黃酮提取的影響因素很多，為了提高黃酮的生產(chǎn)工藝，增效減能，必須要對各影響因素進行優(yōu)化。本文利用均勻設(shè)計法，通過對超聲波法和微波法提取柑橘皮中總黃酮的條件進行比較研究，并以蘆丁為對照品，271 nm為檢測波長，用紫外分光光度法測定了柑橘皮中的總黃酮。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

UV-2550型紫外分光光度計：日本島津公司；SB-3200型超聲波清洗器（超聲功率180W）：寧波新芝生物科技有限公司；AE240型雙量程分析天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；LWMC-201型微波化學反應器（功率650 W）：南京旋光科技有限公司；JYL-350型料理機：九陽股份有限公司；HG202-2A型電熱恒溫烘箱：南京實驗儀器廠。

1.1.2 試劑

蘆丁對照品（含量≥98%）：天津一方科技有限公司；無水乙醇（分析純）：廣州化學試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液制備

準確稱取干燥恒重的蘆丁對照品31.20mg，用50%乙醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，得312 μg/mL對照品溶液，冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 樣品溶液制備

將市售的新鮮柑橘，去肉留皮，將皮剪成小塊薄片于60℃干燥至恒重，用料理機粉碎成粉末，置于干燥器中備用。稱取一定質(zhì)量的柑橘皮粉末，加入一定濃度的乙醇溶液，分別進行微波處理或超聲波處理，以相應濃度的乙醇溶液為參比測定吸光度，必要時將樣品溶液稀釋。

2 結(jié)果與討論

2.1 標準曲線的繪制

將不同濃度的對照品溶液，在波長271 nm處，以50%乙醇為參比，測定吸光度值A(chǔ)。以濃度C（μg/mL）為橫坐標，吸光度值A(chǔ)為縱坐標，得到線性回歸方程：A=0.02461C+0.04612（r＝0.9993）。蘆丁對照品濃度在6.2 μg/mL~56 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

2.2 測定波長的選擇

黃酮類化合物在200 nm~400 nm區(qū)域內(nèi)存在2個主要吸收峰：峰帶Ⅰ220 nm~280 nm和峰帶Ⅱ300 nm~400 nm[13]。將對照品和樣品溶液分別進行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)對照品溶液在260 nm和360 nm附近有最大吸收，樣品溶液在280 nm和320 nm附近有特征峰，見圖1。

由于提取溶液與對照品溶液的吸收光譜有一定差異，為兼顧對照品和樣品溶液的吸收特征，選擇271 nm為測定波長。

2.3 提取條件的選擇

利用均勻設(shè)計法，選擇提取溫度、時間、乙醇濃度、料液比為超聲波提取的考察因素；選擇提取功率、時間、乙醇濃度、料液比為微波提取的考察因素；因素水平表分別見表1、表3。以新奇士橙皮為試樣，超聲波和微波試驗方案和結(jié)果分別見表2、表4。

表1 超聲波提取因素水平表Table 1 Factors and levels of ultrasound extraction

表2 超聲波提取U10（108）擬水平均勻設(shè)計方案與結(jié)果Table 2 Ultrasonic extraction results of drafting level uniform desigh method

表3 微波提取因素水平表Table 3 Factors and levels of microwave extraction

表4 微波提取U10（108）均勻設(shè)計方案與結(jié)果Table 4 Microwave extraction results of uniform design method

超聲提取是超聲波對液體中固體物質(zhì)作用時，產(chǎn)生空化效應，造成生物細胞壁及整個生物體的破裂，加速溶劑進入細胞。同時，超聲波的振動作用強化了胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴散和溶解，使化學成分快速進入溶劑中，從而達到提取的目的[14]。微波提取是透過對微波透明的溶劑，到達植物物料的內(nèi)部，使細胞內(nèi)溫度突然升高，連續(xù)的高溫使其內(nèi)部壓力超過細胞壁膨脹的能力，致細胞破裂，細胞內(nèi)的物質(zhì)自由流出傳遞至周圍的溶劑中被溶解[15]。

從試驗結(jié)果來看，微波提取耗時更短，且提取率更高，總體效果優(yōu)于超聲波。因此，本試驗采用微波法作為總黃酮的提取方法，選擇微波提取的較優(yōu)工藝條件為：輻射功率60%，輻射時間7 min，乙醇濃度50%，料液比 1∶45 g/mL。

2.4 精密度試驗

準確移取一定體積的微波樣品溶液于10 mL具塞比色管中，加相應濃度的乙醇溶液定容至刻度，搖勻，在波長271 nm處，以相應濃度的乙醇溶液作參比，測定其含量，重復6次，結(jié)果見表5。

表5 微波提取的精密度試驗結(jié)果Table 5 The precision experiment results of microwave extraction

由表5可知，微波的RSD為0.51%，表明儀器穩(wěn)定性較好。

2.5 重復性實驗

精確稱取一定質(zhì)量的新奇士橙皮粉末若干份，按所選擇的微波提取方案進行操作，得到樣品溶液上機測定其含量，結(jié)果見表6。

表6 微波提取的重復性實驗結(jié)果Table 6 The repetition experiment results of microwave extraction

由表6可知，微波法的重復性較好。

2.6 加標回收試驗

精確稱取一定質(zhì)量的蘆丁對照品，加入到柑橘皮樣品中，并按所選擇的微波提取方案進行操作，得到樣品溶液上機測定其含量，結(jié)果見表7。

表7 微波提取加標回收實驗結(jié)果Table 7 The recovery experiment results of microwave extraction

由表7可知，微波法的平均加標回收率為99.5%（RSD＝2.2%，n＝4）。

2.7 穩(wěn)定性試驗

分別取同一份微波樣品溶液，置于室溫下，間隔一定時間進行測定。在 0、0.5、3.5、6.0、30.5 h樣品溶液的吸光度分別為 0.551、0.550、0.546、0.546、0.541。結(jié)果表明，微波提取的樣品溶液在30 h內(nèi)基本穩(wěn)定，RSD為0.82%。

2.8 柑橘皮樣品中總黃酮含量的測定

選取市售的5種不同品種柑橘，按所選擇的微波提取方案測定其總黃酮含量，結(jié)果見表8。

表8 不同柑橘皮樣品中總黃酮含量結(jié)果Table 8 The total flavonoids content in different citrus peels(n=4)

3 結(jié)論

利用均勻設(shè)計法，對超聲波和微波提取柑橘皮中總黃酮的條件進行研究并比較，微波法的總體提取率高于超聲波法。微波提取柑橘皮中總黃酮的較優(yōu)條件是：輻射功率60%，輻射時間7 min，乙醇濃度50%，料液比1∶45(g/mL)；結(jié)合紫外分光光度法測定了柑橘皮中總黃酮的含量。樣品制備比較簡單，操作方便，快捷，彌補了氯化鋁顯色法的不足，結(jié)果較為滿意。本文研究的提取條件也為柑橘皮中總黃酮的開發(fā)和評價提供實驗數(shù)據(jù)和參考。

[1]Wilmsen P K,Spada D S,Salvador M.Antioxidant activity of the flavonoid hesperidin in chemical and biological systems[J].Agric Food Chem,2005,53(12):4757-4761

[2]Danila Di Majo,Marco Giammanco,Maurizio La Guardia,et al.Flavanones in Citrus fruit:Structure-antioxidant activity relationships[J].Food research international,2005,38(10):1161-1166

[3]Qingguo Tian,Edward G Miller,G K Jayaprakasha,et al.An improved HPLC method for the analysis of citrus limonoids in culture media[J].Journal of Chromatography B,2007,846(1/2):385-390

[4]Feras Imad Kanaze,Chrysi Gabrieli,Eugene Kokkalou,et al.Simultaneous reversed-phase high-performance liquid chromatographic method for the determination of diosmin,hesperidin and naringin in different citrus fruit juices and pharmaceutical formulations[J].Journal of pharmaceutical and biomedical analysis,2003,33(2):243-249

[5]裴凌鵬,惠伯棣,金宗濂,等.黃酮類化合物的生理活性及其制備技術(shù)研究進展[J].食品科學,2004,25(2):203-207

[6]董文庚,鄧曉麗,苗鳳智,等.HPLC法測定銀杏葉中黃酮的含量[J].理化檢驗-化學分冊,2005,41(8):563-565

[7]Feras Imad Kanaze,Eugene Kokkalou,Manolis Georgarakis,et al.A validated solid-phase extraction HPLC method for the simultaneous determination of the citrus flavanone aglycones hesperetin and naringenin in urine[J].Journal of pharmaceutical and biomedical analysis,2004,36(1):175-181

[8]畢和平,韓長日,王芳,等.分光光度法測定破布葉中總黃酮[J].廣東化工,2006,33(3):43-45

[9]蘇東林,單楊,李高陽.比色法測定柑桔皮中總黃酮含量的研究[J].中國釀造,2008,27(3):69-74

[10]胡鋼亮,呂秀陽,吳建國,等.近紅外漫反射光譜法直接測定銀杏葉提取物粉末中總黃酮的含量[J].藥物分析雜志,2004,24(1):18-20

[11]呂凜,陶寧萍.紫外分光光度法檢測桔皮中總黃酮含量的方法研究[J].現(xiàn)代食品科技,2009,25(2):217-220

[12]蘇東林,單楊,李高陽.紫外分光光度法測定柑桔皮中總黃酮的含量[J].食品研究與開發(fā),2007,28(8):124-128

[13]姚新生.天然藥物化學[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2001:191-196

[14]郭孝武,馮岳松.超聲提取分離[M].北京:化學工業(yè)出版社,2008:31-35

[15]周晶,馮淑華.中藥提取分離新技術(shù)[M].北京:科學出版社,2010:106-108

UV Spectrophotometric Measurement of Total Flavonoids in Citrus Peels

XU Xu-yao,XIAO Xu-feng,MEI Dan-dan,YU Bing-sheng*
(Chemistry Science and Technology School,Zhanjiang Normal University,Development Center for New Materials Engineering&Technology in Universities of Guangdong,Zhanjiang 524048,Guangdong,China)

2011-12-23

徐旭耀（1982—），男（漢），實驗師，碩士，主要從事色譜和光譜分析研究。

*通信作者