超聲誘導(dǎo)法提取土豆中多酚氧化酶的工藝研究

熊海濤

（陜西理工學(xué)院化學(xué)系，陜西漢中723001）

超聲誘導(dǎo)法提取土豆中多酚氧化酶的工藝研究

熊海濤

（陜西理工學(xué)院化學(xué)系，陜西漢中723001）

應(yīng)用超聲誘導(dǎo)法對(duì)土豆中多酚氧化酶進(jìn)行了粗提,并以鄰苯二酚為底物考察了溫度、時(shí)間和固液比對(duì)土豆多酚氧化酶活性的影響并進(jìn)行了正交試驗(yàn)。結(jié)果表明：土豆多酚氧化酶酶促反應(yīng)產(chǎn)物在408 nm下有最大吸收峰，提取最佳工藝條件為：超聲溫度40℃，超聲時(shí)間270 s，超聲固液比為60%，經(jīng)超聲波強(qiáng)化提取活力提高到原先的4.62倍。而正交試驗(yàn)優(yōu)選出超聲提取的最佳工藝：溫度為35℃，時(shí)間240 s，液料比為70%。

土豆；多酚氧化酶；超聲波；提取

Abstract:In this paper,potato polyphenol oxidase was extracted by ultrasonic decomposition method.and the effect of different temperature,time,mass fraction on its activity with Catechol as substrate was studied.The results showed that the product of enzymatic reactions has the soret peak at 408 nm and the optimum conditions were that supersonic wave extracting temperature at 40℃,treatment at 270 seconds,and the papaya of 60%mass fraction.In addition,treatment with ultrasonic wave could enhance the enzyme activity as much as 4.62 times.And the result of orthogonal experimental design indicated that optimal conditions were ultrasonic tempreture 35℃,extraction time 240 s and the ratio of buffering liquid to konjak 70%,respectively.

Key words：potato;polyphenol oxidase;ultrasonic wave;extraction

在人類(lèi)和動(dòng)植物活的機(jī)體中，普遍存在一類(lèi)天然催化劑——酶類(lèi)[1]。酶的制備一般包括3個(gè)基本步驟，即提取、純化和結(jié)晶（或制劑），而酶的提取可采用多種方法，常用的細(xì)胞破碎法有高速組織搗碎[2]、玻璃勻漿器勻漿[3]、反復(fù)凍融法[4]、化學(xué)處理法、超聲波處理法[5]等。多酚氧化酶（polyphenol oxidase,簡(jiǎn)稱(chēng)PPO）是一類(lèi)廣泛存在于植物體內(nèi)的能催化多酚類(lèi)氧化成醌類(lèi)的含銅質(zhì)金屬酶，它是由核基因編碼，在細(xì)胞之中合成通過(guò)一定方式轉(zhuǎn)運(yùn)至質(zhì)體內(nèi)而成為具酶活性的形式[6]。PPO具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值與食品工業(yè)，三廢處理，醫(yī)藥衛(wèi)生關(guān)系較密切，如利用PPO增強(qiáng)植物對(duì)病原菌的抗性改善紅茶品質(zhì)和啤酒風(fēng)味，抑制果蔬、動(dòng)物制品的褐變，以及利用PPO生物傳感器和固定化酶制品檢測(cè)環(huán)境中多酚類(lèi)物質(zhì)，處理工業(yè)三廢﹑及農(nóng)藥降解產(chǎn)生的酚和芬胺等，故PPO具有較大開(kāi)發(fā)價(jià)值[7]。20世紀(jì)90年代以后，植物多酚氧化酶的提取大多采用傳統(tǒng)提取方法—緩沖溶液法（高速組織搗碎）[2-3，8-10]、丙酮法（反復(fù)凍融法）[2，4]，再經(jīng)過(guò)各種分級(jí)沉淀﹑鹽析﹑結(jié)晶﹑洗滌﹑層析等過(guò)程。冷丙酮法效果較差，酶活較低，可能跟丙酮引起酶蛋白不可逆變性有關(guān)，緩沖溶液法提取的酶的活性雖高于冷丙酮法。超聲波提取是利用超聲波具有的機(jī)械效應(yīng)，空化效應(yīng)和熱效應(yīng)，通過(guò)增大介質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)速度、增大介質(zhì)的穿透力以提取生物有效成分[11]，其提取的特點(diǎn)主要是:（1）不需加熱，可以避免加熱對(duì)有效成分的不良影響；（2）提取率高，節(jié)省原料；（3）節(jié)約溶劑；（4）有利于保持有效成分的生理活性；（5）提取物有效成分含量高，有利于進(jìn)一步精制[12-13]，因此在天然產(chǎn)物有效成分的提取過(guò)程中也日益得到科研工作者們的充分重視[5]。

本文以新鮮土豆為原料，旨在通過(guò)超聲誘導(dǎo)法提取土豆中多酚氧化酶,尋找其提取的最佳工藝條件,一方面為科學(xué)控制土豆加工過(guò)程中的酶促褐變提供參考，另一方面期望對(duì)PPO的應(yīng)用有所幫助。

1 材料與方法

1.1 原料

土豆：從漢中當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)購(gòu)得，新鮮，無(wú)病蟲(chóng)害，個(gè)體完整無(wú)損害，表皮無(wú)霉。

1.2 儀器與試劑

鄰苯二酚、磷酸氫二納、磷酸二氫鈉、檸檬酸均為分析純，水均用二次蒸餾水。

HJ-I型磁力攪拌器：上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海手術(shù)器械廠；1800型高速離心機(jī)：河北黃驊市航天儀器廠；電子精密天平：GR-2000型日本；紫外分光光度計(jì)：中國(guó)普析；冰箱；超聲清洗儀：日本本多。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 PPO粗酶液提取

新鮮土豆先用自來(lái)水、再用蒸餾水洗凈，擦干，削去1 mm厚果皮取2 g樣品放入5 mL（固液比為1∶2.5）磷酸緩沖液（pH為7）的研缽中，研磨1min。接著在HJ-I型磁力攪拌器中攪拌15 min，然后在600 W功率的超聲波提取機(jī)上處理一段時(shí)間，接著1800-1型離心沉淀機(jī)中離心15 min，萃取上清液為PPO提取液。

1.3.2 酶反應(yīng)產(chǎn)物吸收曲線掃描

酶液以1∶4稀釋?zhuān)磻?yīng)體系為0.5mL酶液+0.04mol/L鄰苯二酚+1.5 mL 0.01 mol/L磷酸鹽沖液（pH為7.0）混勻反應(yīng)1min后使用紫外分光光度計(jì)在300 nm~600 nm下進(jìn)行吸收曲線掃描。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶促反應(yīng)吸收曲線掃描

酶促反應(yīng)產(chǎn)物在408 nm處有最大吸收峰，因此在后試驗(yàn)中采用408 nm為工作波長(zhǎng)測(cè)定其吸光度。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.2.1 超聲處理時(shí)間對(duì)酶提取的影響

在室溫25℃下，于pH為7.0的磷酸緩沖溶液中加濃度為0.05 mol/L的底物2.0 mL，酶提取液1.0 mL，固液比為30%，在600 W功率的超聲波提取儀上分別進(jìn)行 60、120、180、240、260、270、280，300，360 s，離心，得樣品溶液后測(cè)定酶活力[14]，以酶活力對(duì)超聲時(shí)間作圖1。

由圖1可以看出，超聲開(kāi)始的一段時(shí)間里，隨著超聲波處理時(shí)間的延長(zhǎng)，形成的氣泡越多，高頻振蕩越劇烈，吸收的聲能越大，破壁的效果越好，因而酶的溶出增多，但并不是超聲時(shí)間越長(zhǎng)酶的濃度越高。處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)提取物由于超聲波的強(qiáng)烈震蕩及熱效應(yīng)的作用而被破壞，特別是酶類(lèi)。超聲波處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致酶活力下降，并且植物組織中大量細(xì)胞破裂導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大量不溶物及較多的粘液質(zhì)等混入提取液中，使溶液中雜質(zhì)增多黏度增大，從而增大了傳質(zhì)阻力影響有效成分的溶出。結(jié)果表明：超聲時(shí)間為270 s時(shí)提取效果最佳。

2.2.2 超聲波處理溫度對(duì)酶提取的影響

稱(chēng)取2 g土豆加入5 mL磷酸緩沖液（pH為7.0）研磨1 min后用600 W的超聲波分別在不同溫度下進(jìn)行超聲處理，離心，得到樣品溶液后測(cè)定酶活力見(jiàn)圖2。

由圖2可知，隨著溫度的升高酶活力增大，達(dá)到40℃如繼續(xù)升高溫度含量呈下降趨勢(shì)，原因可能是超聲溫度升高了多酚氧化酶在溶劑中的溶解度，同時(shí)提取液的粘度減小，擴(kuò)散系數(shù)增加，促使提取速度加快，從而提高了提取物的含量，但溫度再升高活性成分被破壞，雜質(zhì)的溶出量增加，給后續(xù)操作帶來(lái)不便，成本費(fèi)用增大，而且還造成了部分溶劑的損失，因此超聲提取溫度40℃為宜。

2.2.3 超聲處理固液比對(duì)酶提取的影響

稱(chēng)量一定量土豆與定量緩沖溶液（pH為7.0）進(jìn)行研磨，配制成不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的果漿在室溫在超聲處理270 s，離心，得樣品溶液后測(cè)定酶活力見(jiàn)圖3。

由圖3可見(jiàn)在固液比為20%~80%隨著比例的增大細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓加大，酶的溶出速度加快，酶的提取活性增加但當(dāng)達(dá)到60%后再增大固液比酶活性降低，這是由于緩沖液加入量相對(duì)減少，實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程可發(fā)現(xiàn)溶液較黏稠，則原料顆粒被破碎的機(jī)會(huì)越小，影響了超聲波的效果，不利于酶的溶出，因此固液比以60%最適。

2.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)多因素共同作用的正交試驗(yàn)。本文以超聲波處理時(shí)間、液料比、超聲提取溫度為主要考察因素，每個(gè)因素設(shè)立3個(gè)水平，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)，以從土豆中提取的多酚氧化酶的存在酶活力為指標(biāo)，優(yōu)選超聲波法提取魔芋中多酚氧化酶的工藝參數(shù)。正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1，結(jié)果與分析見(jiàn)表2。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 factors of thogonal test and levels

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Result and analysis of thogonal test

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證分析Table 3 Verification analysis of thogonal test result

由表1和表2可知，3個(gè)因素對(duì)提取效果的影響主次順序?yàn)椋撼晻r(shí)間＞超聲溫度＞液料比；最優(yōu)水平的組合為A2B2C3。同時(shí)，對(duì)正交優(yōu)化后所選擇的工藝條件進(jìn)行了驗(yàn)證（見(jiàn)表3所示），結(jié)果表明正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較可靠。

3 結(jié)論

本文通過(guò)單因素試驗(yàn)，采用超聲波法提取土豆中多酚氧化酶的最佳提取工藝條件：超聲時(shí)間270 s，果漿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%，溫度為40℃，這時(shí)酶活力是未經(jīng)超聲波處理的4.62倍。而正交試驗(yàn)優(yōu)選出超聲提取的最佳工藝為溫度為35℃，時(shí)間240 s，液料比為70%；極差分析表明：影響因素大小順序?yàn)槌晻r(shí)間>溫度>液料比。因此，提取土豆多酚氧化酶使用超聲誘導(dǎo)法效率更高，而食品工作者可以通過(guò)調(diào)節(jié)pH和溫度（采用瞬時(shí)高溫的方法將其鈍化）來(lái)控制土豆褐變的程度。

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Study on Extracting Technology of Polyphenol Oxidase from Potato by the Ultrasonic Decomposition Method

XIONG Hai-tao
（Department of Chemistry,Shaanxi University of Techonology,Hanzhong 723001,Shaanxi,China）

2011-12-29

陜西理工學(xué)院碩士專(zhuān)項(xiàng)基金（SLGQD0510）

熊海濤（1979—），男（漢），講師，碩士，主要從事食品研究與相關(guān)分析。