金針菇黃酮類化合物清除DPPH自由基活性

方玉梅，譚萍，王毅紅，張春生

（貴州六盤水師范學(xué)院，貴州水城553004）

金針菇黃酮類化合物清除DPPH自由基活性

方玉梅，譚萍，王毅紅，張春生

（貴州六盤水師范學(xué)院，貴州水城553004）

以70%乙醇為溶劑提取金針菇黃酮類化合物，并以抗壞血酸（VC）和VE為對(duì)照品，采用DPPH法研究金針菇黃酮提取物對(duì)自由基的清除作用。結(jié)果表明：金針菇黃酮提取物具有抗氧化作用，在其濃度為44.775 μg/mL時(shí)其清除率可達(dá)17.24%，顯著高于相同濃度下的VC和VE的清除率。認(rèn)為金針菇黃酮提取物是一種有前途的天然抗氧化劑。

金針菇；黃酮；DPPH自由基

Abstract:The activity component was extracted with 70%ethanol.Using the assay system of DPPH,the antioxidant activities of the Flammulina velutipes Flavonoids were studied and compared with those of VEand assorbic acid.Results showed that the extracts of the Flammulina velutipes Flavonoids could inhibit lipid peroxidation and scavenge active oxygen free radicals.The elimination of the density of the Flammulina velutipes Flavonoids(44.775 μg/mL)was attained by 17.24%,and remarkable exceeded the same density VEand assorbic acid.The Flammulina velutipes flavonoids extracts showed strongest inhibitory effect on the antioxidation of superoxidized anionic and lipid peroxidantion.

Key words：the Flammulina velutipes；flavonoids；DPPH free radical

金針菇（Flammulina velutiper（Fr.）Sing.）學(xué)名毛柄金錢菌毛腳傘菌，因其菌柄細(xì)長(zhǎng)，似金針菜，故稱金針菇，屬擔(dān)子菌綱傘菌目白蘑科金錢菌屬，且具有很高的藥用食療作用。金針菇在自然界廣為分布，中國(guó)、日本、俄羅斯、歐洲、北美洲、澳大利亞等地均有分布。在中國(guó)北起黑龍江，南至云南，東起江蘇，西至新疆均適合金針菇的生長(zhǎng)[1]。金針菇既是一種美味食品，又是較好的保健食品，金針菇的國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)日益廣闊。金針菇含有人體必需氨基酸成分較全，其中賴氨酸和精氨酸含量尤其豐富，且含鋅量比較高，對(duì)增強(qiáng)智力尤其是對(duì)兒童的身高和智力發(fā)育有良好的作用，人稱“增智菇”。金針菇有增強(qiáng)機(jī)體對(duì)癌細(xì)胞的抗御能力，常食金針菇還能降膽固醇，預(yù)防肝臟疾病和腸胃道潰瘍，增強(qiáng)機(jī)體正氣，防病健身，還可抑制血脂升高，降低膽固醇，防治心腦血管疾??；抗菌消炎、清除重金屬鹽類物質(zhì)、抗腫瘤的作用[2-4]。

金針菇作為我國(guó)重要的、普遍栽培的食用菌之一，對(duì)于金針菇次生代謝產(chǎn)物（黃酮類化合物）在國(guó)內(nèi)系統(tǒng)的研究報(bào)道卻較少。而對(duì)金針菇的研究大多集中在栽培技術(shù)、加工工藝及營(yíng)養(yǎng)成分分析，而對(duì)其黃酮類化合物抗氧化性的研究未見報(bào)道。本試驗(yàn)以金針菇中總黃酮得率為考察指標(biāo)，對(duì)影響金針菇總黃酮提取率的因素（乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度）進(jìn)行了探討，以得到金針菇總黃酮提取的條件優(yōu)化，篩選出金針菇總黃酮提取的最佳實(shí)驗(yàn)條件。并采用DPPH法研究金針菇中黃酮化合物對(duì)DPPH自由基的清除作用。測(cè)定金針菇黃酮化合物的抗氧化性，以期為金針菇的進(jìn)一步開發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

金針菇：三明1號(hào)貴州六盤水市售。

二苯代苦味酰自由基（DPPH）：Sigma公司；抗壞血酸（VC）：廣州日康食用化工有限公司；VE西安藍(lán)天生物工程有限責(zé)任公司；蘆丁（rutin）標(biāo)準(zhǔn)品：比利時(shí)進(jìn)口，北京化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇，Tris，亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉等試劑均為市售國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

UV-9100紫外分光光度計(jì)：北京瑞利公司；sartoriusBS110S電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；FW80型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：天津泰斯特儀器有限公司。

1.3 金針菇黃酮類化合物樣品的制備[5]

1.3.1 金針菇黃酮類化合物的提取純化方法

金針菇黃酮類化合物的提取：準(zhǔn)確稱取新鮮金針菇（65℃烘干至恒重）1 g，于燒瓶中加入30 mL 70%的乙醇，70℃水浴浸提2.5 h，過濾，并用70%乙醇定容至50 mL，得到金針菇黃酮提取液。

1.3.2 金針菇黃酮類化合物樣品濃度測(cè)定

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：稱取在120℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用70%的乙醇溶解并定容至100 mL，使其濃度為100 μg/mL。將蘆丁溶液用70%的乙醇稀釋成 0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL，各取1 mL于試管中，加70%的乙醇1 mL，加5%NaNO2溶液 0.3 mL，搖勻，靜置 6 min，然后加 10%AL（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，最后再加4%NaOH溶液2 mL，搖勻，靜置15 min~20 min后，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法，以濃度（C，μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光值（A，510 nm）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程：

金針菇黃酮類化合物樣品含量的測(cè)定步驟：分別吸取1 mL樣品于10 mL容量瓶中，用70%乙醇稀釋到刻度。分別取1 mL稀釋液于試管中，加70%乙醇1 mL，依次加入5%NaNO20.3 mL，混勻后靜置6 min，加 10%AL（NO3）30.3 mL，混勻后靜置 6 min，加 4%NaOH溶液2 mL，搖勻，靜置10 min，同時(shí)以70%乙醇代替樣品液配制空白試劑。在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A。

1.4 金針菇黃酮類化合物對(duì)DPPH自由基的清除實(shí)驗(yàn)[6-7]

DPPH在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，呈紫色，在517 nm處有強(qiáng)吸收，在有自由基清除劑存在時(shí)，DPPH的孤電子被配對(duì)，使其顏色變淺，在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度變小，且這種顏色的變淺程度與配對(duì)電子數(shù)成化學(xué)計(jì)量關(guān)系。因此，可通過在此波長(zhǎng)處吸光度的測(cè)定來評(píng)價(jià)自由基的清除情況。

DPPH溶液的配制:準(zhǔn)確稱取44 mgDPPH,用無(wú)水乙醇溶解并定容于100 mL容量瓶中,DPPH濃度為120 μmo1/L,避光保存（0℃～4℃）。

對(duì)照：0.1 mL無(wú)水乙醇與3 mL120 μmo1/L DPPH溶液加入同一試管中,搖勻,在黑暗中放置30 min,以無(wú)水乙醇為空白在517 nm測(cè)定其吸光度Ac。

將金針菇黃酮提取液分別取0.1 mL與3 mL 120 μmo1/L DPPH溶液加入同一試管中,搖勻,在黑暗中放置30 min,以無(wú)水乙醇為空白在517 nm測(cè)定其吸光度Ai,并以下式計(jì)算其清除率:

式中：Ac為0.1 mL無(wú)水乙醇加3.0 mL DPPH溶液的吸光度；Ai為0.1mL待測(cè)液加3.0mLDPPH溶液的吸光度。

按照上面公式計(jì)算清除率,清除率越大抗氧化能力越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 金針菇黃酮類化合物樣品濃度測(cè)定結(jié)果

根據(jù)試驗(yàn)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.002616x-0.01314（式中Y為吸光度，x為濃度，（μg/mL）），見圖1。

計(jì)算樣品液濃度，結(jié)果如下：

在510 nm下測(cè)得金針菇黃酮提取液的吸光度Y=0.104，根據(jù)上述公式計(jì)算得到：x=44.775 μg/mL

2.2 對(duì)DPPH自由基的清除作用

分別取金針菇黃酮提取液 0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mL 分別加入 70%的乙醇 0.08、0.06、0.04、0.02、0 mL，作為不同濃度的金針菇黃酮類化合物的樣品液，分別標(biāo)示為樣品1~樣品5。

測(cè)得Ac=0.957，根據(jù)公式清除率/%=[（Ac-Ai）/Ac]×100%計(jì)算清除率，其結(jié)果如表1。

表1 不同濃度的金針菇黃酮提取液對(duì)DPPH的清除作用Table 1 Elimination of DPPH was trained on the different density of the Seeding of Tartary Buckwheat Flavonoids

由表1可知，金針菇黃酮提取液對(duì)DPPH具有較好的清除作用，且金針菇黃酮清除DPPH的能力隨著加入量的增加而上升，即清除率與黃酮的用量存在著一定的量效關(guān)系。且在提取液濃度為44.775 μg/mL時(shí)，清除效果最好，達(dá)到17.24%。

2.3 不同抗氧化劑清除DPPH自由基的比較

由表1我們可知，金針菇黃酮提取液對(duì)DPPH的最佳清除濃度是44.775 μg/mL，將VC、VE分別配制成44.775 μg/mL的濃度，然后分別取金針菇黃酮提取液、VC、VE3 種抗氧化劑 0.1 mL 與 3 mL120 μmo1/LDPPH溶液加入同一試管中,搖勻,在黑暗中放置30 min,以無(wú)水乙醇為空白在517 nm測(cè)定其吸光度Ai，并分別計(jì)算其清除率，結(jié)果見下表2。

表2 不同抗氧化劑清除DPPH自由基的比較Table2 Compared elimination of DPPH of the different antioxidant action medicinal

由表2可以看出，在相同濃度下，金針菇期黃酮提取液的抗氧化能力顯著高于VC與VE的。

3 結(jié)論

1）金針菇中含有大量的黃酮類化合物，這些黃酮類化合物對(duì)DPPH自由基有很強(qiáng)的清除能力。而且黃酮類化合物對(duì)DPPH自由基的清除效果與黃酮濃度成正比。

2）在相同濃度下，金針菇黃酮提取液的抗氧化能力顯著高于VC與VE的。

3)金針菇中黃酮類化合物含量高，提取工藝簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，并能有效清除自由基，是較強(qiáng)抗氧化性的保健食品，有很大的開發(fā)前景。

[1]卯曉嵐.中國(guó)大型真菌[M].河南:河南科學(xué)技術(shù)出版社,2000:165-166

[2]徐錦堂.中國(guó)藥用真菌學(xué)[M].北京:北京醫(yī)科大學(xué)中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社,1997:231-235

[3]申進(jìn)文,賈身茂.金針菇營(yíng)養(yǎng)成分研究[J].中國(guó)食用菌,1997(5):36-38

[4]康潔,陳若蕓.構(gòu)菌發(fā)酵菌絲體化學(xué)成分的研究[J].中國(guó)中藥雜志,2005(3):12-13

[5]張萍,王玉珠,李紅寧,等.蕎麥中生物類黃酮的提取方法研究[J].食品研究與開發(fā),2007(2):45-48

[6]汪河濱,白紅進(jìn),王金磊,等.黑果枸杞色素清除自由基活性的研究[J].食品研究與開發(fā),2006(11):8-10

[7]譚萍,方玉梅,張春生,等.苦蕎種子黃酮類化合物清除DPPH自由基的作用[J].食品研究與開發(fā),2008(12):20-23

Study on Scavenging DPPH Radical Activity with Flavonoids in Flammulina Velutipes

FANG Yu-mei,TAN Ping,WANG Yi-hong,ZHANG Chun-sheng
（Liu Panshui Normal College，Shuicheng 553004,Guizhou,China）

2011-11-10

方玉梅（1982—），女（布依），講師，碩士，主要從事植物生理學(xué)與微生物的教學(xué)與研究。