HPLC-梯度洗脫測(cè)定保健食品中吡啶甲酸鉻

那海秋，馬殿君，趙飛

（遼寧省食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧沈陽(yáng)110023）

HPLC-梯度洗脫測(cè)定保健食品中吡啶甲酸鉻

那海秋，馬殿君，趙飛

（遼寧省食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧沈陽(yáng)110023）

建立保健食品中吡啶甲酸鉻成分的檢測(cè)方法。高效液相色譜法，三元流動(dòng)相體系-梯度洗脫，C18反向色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），柱溫 25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為 254 nm，流速為 0.5 mL/min，進(jìn)樣量為 10 μL。吡啶甲酸鉻在 0～92.88 μg/mL之間具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R=0.9997，2個(gè)濃度平均加標(biāo)回收率分別為92.90%、96.19%。本方法對(duì)保健食品中吡啶甲酸鉻具有較好的分離效果和精密度，梯度洗脫縮短了樣品檢驗(yàn)時(shí)間，適用于保健食品中吡啶甲酸鉻的定量檢測(cè)。

吡啶甲酸鉻；高效液相色譜；梯度洗脫；保健食品

Abstract:To develop a method for determining the content of chromium picolinate in sanitarian food.The HPLC was carried out with C18-BP(5 μm,4.6 mm×250 mm)column set at 25 ℃.The mobile phase was phosphoric acid,methanol and acetonitrile with flow rate of 0.5 mL/min.The detection wavelength was set at 254 nm,and the sample size was 10 μL.The linearity of the method ranged from 0 to 92.88 μg/mL and R=0.9997.The average recovery rate was 92.90%and 96.19%for 2 kinds of concentration.High-performance chromatogrphic method is steady and reliable for detecting the concentration of chromium picolinate and it is applicable for analyzing chromium picolinate in sanitarian food.

Key words：chromium picolinate;HPLC;gradient elution;sanitarian food

過(guò)去鉻和其他一些元素如鎳、鉛、鎘等一樣，一直被認(rèn)為是對(duì)人畜有毒有害的元素之一[1]。隨著現(xiàn)代科學(xué)研究的不斷發(fā)展，到20世紀(jì)70年代，人類才逐漸認(rèn)識(shí)到鉻是人和動(dòng)物必需的微量元素[2]。鉻有3種價(jià)態(tài)，有二價(jià)鉻、三價(jià)鉻及六價(jià)鉻，其中六價(jià)鉻毒性最大。而三價(jià)鉻是鉻在人畜體內(nèi)存在的穩(wěn)定形式，其化合物參與骨骼的形成和蛋白質(zhì)、脂肪、糖代謝及胰島素的生化過(guò)程，并對(duì)血紅蛋白合成及造血過(guò)程具有促進(jìn)作用[2]。吡啶甲酸鉻就是三價(jià)鉻化合物，可以被人體很好的吸收，因此吡啶甲酸鉻是一種被食品藥品監(jiān)督管理局允許能夠添加到保健食品中的功效成分之一。根據(jù)《營(yíng)養(yǎng)素補(bǔ)充劑申報(bào)與評(píng)審規(guī)定》中規(guī)定三價(jià)鉻日攝入量范圍可知，吡啶甲酸鉻作為保健食品中的功效成分其含量控制非常重要[3]。

1 材料和方法

1.1 試劑

甲醇、乙睛色譜純；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀分析純；吡啶甲酸鉻對(duì)照品進(jìn)口，批號(hào)：13363，干燥條件：105℃干燥4 h。

1.2 儀器

高效液相色譜儀（型號(hào)LC2010）：日本島津公司，帶紫外檢測(cè)器，色譜工作站；DT5-2離心機(jī)：北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；AS10000377超聲波清洗儀：天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

1.3 色譜條件

C18反向色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖溶液∶甲醇∶乙腈梯度洗脫，見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Conditions of gradient elution

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

稱取105℃干燥4 h的吡啶甲酸鉻對(duì)照品0.01161 g于25 mL容量瓶中，加甲醇∶水=1∶1完全溶解并定容至刻度，即為0.4644 mg/mL吡啶甲酸鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)系列

取上述吡啶甲酸鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL 分別置于 10 mL 容量瓶中，以甲醇∶水=1∶1水溶液定容至刻度（相當(dāng)于每毫升含吡啶甲酸鉻分別為 0、4.644、9.288、18.576、37.152、55.728、74.304、92.88 μg），搖勻，經(jīng) 0.45 μm 濾膜過(guò)濾后備用。

1.4.3 樣品處理

準(zhǔn)確稱取混勻的樣品約2 g左右（精確至0.1 mg），于25 mL容量瓶中，加甲醇∶水=1∶1水溶液約20 mL，超聲提取10 min，并用甲醇∶水=1∶1水溶液定容至刻度，搖勻后轉(zhuǎn)移至離心管中，以3000 r/min離心10 min，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后備用。

1.4.4 測(cè)定

按照上述儀器條件，將標(biāo)準(zhǔn)系列溶液從低到高依次進(jìn)樣上機(jī)測(cè)定，以保留時(shí)間定性，以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)系列濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，并求出回歸方程。樣品溶液依次進(jìn)樣，同樣以保留時(shí)間定性，以峰面積從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線或回歸方程計(jì)算吡啶甲酸鉻濃度。圖1為標(biāo)準(zhǔn)系列中9.288 μg/mL譜圖，圖2為某樣品譜圖。A為吡啶甲酸鉻峰。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇

2.1.1 磷酸鹽緩沖溶液-乙腈體系

首先選擇了磷酸鹽緩沖溶液-乙腈作為流動(dòng)相體系，磷酸鹽緩沖溶液∶乙腈=85∶15，分離效果不好；在此基礎(chǔ)上調(diào)整了流動(dòng)相的比例，磷酸鹽緩沖溶液：乙腈從70∶30到92∶8，其分離效果都不是很好，故對(duì)其它流動(dòng)相體系進(jìn)行了試驗(yàn)。

2.1.2 磷酸鹽緩沖溶液-甲醇-乙腈體系

根據(jù)有關(guān)資料報(bào)道對(duì)磷酸鹽緩沖溶液-甲醇-乙腈流動(dòng)相體系進(jìn)行了試驗(yàn)，當(dāng)磷酸鹽緩沖溶液∶甲醇∶乙腈=85∶10∶5時(shí)樣品中吡啶甲酸鉻與其它組分分離的較好，因此選擇了磷酸鹽緩沖溶液∶甲醇∶乙腈=85∶10∶5 作為流動(dòng)相。

2.1.3 流動(dòng)相中磷酸鹽緩沖溶液pH

試驗(yàn)中對(duì)流動(dòng)相中磷酸鹽緩沖溶液pH進(jìn)行了考察，分別對(duì) pH=3、pH=4、pH=5.8、pH=7.8 進(jìn)行了比對(duì)試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pH不僅對(duì)保留時(shí)間產(chǎn)生影響，而且對(duì)分離效果影響很大。pH=3時(shí)吡啶甲酸鉻保留時(shí)間在19 min~20 min之間，分離效果不理想。pH=4、pH=7.8時(shí)吡啶甲酸鉻保留時(shí)間均在15 min~16 min左右，但兩者分離效果差異很大，pH=7.8時(shí)樣品分離效果不好，且保留時(shí)間漂移較大。pH=4時(shí)分離效果尚可，保留時(shí)間穩(wěn)定，但靈敏度稍差，標(biāo)準(zhǔn)系列中4.644 μg/mL的響應(yīng)值為127088。pH=5.8時(shí)吡啶甲酸鉻保留時(shí)間在14 min左右，保留時(shí)間穩(wěn)定，且相對(duì)其它pH磷酸鹽緩沖溶液分離效果較好，靈敏度較高，標(biāo)準(zhǔn)系列中4.644 μg/mL的響應(yīng)值為184155。綜合考慮分離效果、保留時(shí)間、靈敏度等因素確定流動(dòng)相中磷酸鹽緩沖溶液pH=5.8為最佳。

2.2 梯度洗脫

眾所周知保健食品成分較復(fù)雜，若按上述條件等度洗脫每個(gè)樣品大約需要80 min左右才能完成所有組分的洗脫，造成樣品分析時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，既影響工作效率又浪費(fèi)試劑試藥，因此試驗(yàn)中采用了梯度洗脫法，并對(duì)梯度洗脫時(shí)間進(jìn)行了摸索試驗(yàn)，通過(guò)比較認(rèn)為1.3色譜條件表中洗脫時(shí)間較為合適，45 min既能完成樣品所有組分的洗脫，節(jié)省了近一半的分析時(shí)間，且不影響樣品分析結(jié)果。

2.3 線性關(guān)系

取1.4.2標(biāo)準(zhǔn)系列按上述條件上機(jī)測(cè)定，其結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 吡啶甲酸鉻標(biāo)準(zhǔn)系列檢測(cè)結(jié)果Table 2 Test results of standard series for chromium picolinate

以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)系列濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性回歸方程為：

Y=39994X-4001.5相關(guān)系數(shù)R=0.9997從表2及相關(guān)系數(shù)R可以看出吡啶甲酸鉻濃度在0～92.88 μg/mL之間具有良好的線性關(guān)系。

2.4 吡啶甲酸鉻加標(biāo)回收率、精密度、穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.4.1 加標(biāo)回收率

取已知吡啶甲酸鉻含量為20 mg/100 g的樣品做2個(gè)濃度加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度作6份平行樣品，每份約2 g，濃度一各加0.4644 mg/mL吡啶甲酸鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，濃度二各加0.4644 mg/mL吡啶甲酸鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL，按上述樣品處理方法定容25 mL制備樣品溶液，按上述儀器條件上機(jī)測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 吡啶甲酸鉻加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)Table 3 Standard addition recovery experiments of chromium picolinate

2.4.2 方法精密度試驗(yàn)

取混合均勻相同樣品6份按上述相同方法處理樣品上機(jī)測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 吡啶甲酸鉻方法精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 The results of method precision for chromium picolinate

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將處理好的某樣品及標(biāo)準(zhǔn)系列中18.576 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液分別放置 1、8、16、24、48 h 在相同條件下測(cè)定，其保留時(shí)間、峰面積均無(wú)明顯變化，結(jié)果表明處理后的樣品溶液及標(biāo)準(zhǔn)溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

3 結(jié)論

一般來(lái)說(shuō)保健食品成分都很復(fù)雜，檢測(cè)過(guò)程中影響及干擾因素較多，因此能夠取得好的分離效果非常重要。相對(duì)于GB/T 5009.195-2003保健食品中的吡啶甲酸鉻含量的測(cè)定[4]及參考文獻(xiàn)保健食品中吡啶甲酸鉻的高效液相色譜測(cè)定法[5]，本研究建立的高效液相色譜法—三元流動(dòng)體系梯度洗脫測(cè)定保健食品中吡啶甲酸鉻，具有快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、分離效果好，出峰時(shí)間適中等優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)梯度洗脫大大縮短了檢驗(yàn)時(shí)間。在本實(shí)驗(yàn)研究范圍內(nèi)吡啶甲酸鉻具有良好的線性關(guān)系、回收率及精密度，已運(yùn)用于某些膠囊、片劑保健食品中功效成分—吡啶甲酸鉻的檢測(cè)。

[1]李敏,郭書(shū)明,袁寶清,等.吡啶甲酸鉻的生物學(xué)作用及其應(yīng)用[J].河南畜牧獸醫(yī),1999,20(9)：20-21

[2]李致寶,韋少平,夏中生,等.吡啶甲酸鉻的研究概述及其應(yīng)用進(jìn)展[J].化工技術(shù)與開(kāi)發(fā),2011,40(7)：11-14

[3]國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.國(guó)食藥監(jiān)注[2005]202號(hào)《營(yíng)養(yǎng)素補(bǔ)充劑申報(bào)與評(píng)審規(guī)定(試行)》[S].北京：國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局,2005：2

[4]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部,中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 5009.195-2003食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法理化部分(二)：保健食品中的吡啶甲酸鉻含量的測(cè)定 [S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社出版,2003：543-547

[5]廖一民.保健食品中吡啶甲酸鉻的高效液相色譜測(cè)定法[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)情報(bào)雜志,2005,21(6)：751-753

Determination of Chromium Picolinate in Sanitarian Food with Gradient Elution-HPLC

NA Hai-qiu,MA Dian-jun,ZHAO Fei
（Liaoning Institute for Food and Drug Control,Shenyang 110023,Liaoning,China）

2012-01-12

那海秋（1960—），女（滿），高級(jí)工程師，本科，主要從事食品保健品檢測(cè)及方法研究。