高效毛細管電泳法測定葛根及其制劑腦得生片中葛根素和大豆苷元含量

劉荔貞，馮 鋒，2*，雙少敏

（1.山西大學化學化工學院，山西太原 030006；2.山西大同大學化學與化工學院，山西大同 037009）

高效毛細管電泳法測定葛根及其制劑腦得生片中葛根素和大豆苷元含量

劉荔貞1，馮 鋒1，2*，雙少敏1

（1.山西大學化學化工學院，山西太原 030006；2.山西大同大學化學與化工學院，山西大同 037009）

利用高效毛細管電泳法 （HPCE），配以二極管陣列檢測器測定葛根及其制劑腦得生片中葛根素和大豆苷元的含量。以未涂層彈性石英管柱（57 cm×75μm，有效長度50 cm）為分離通道，60 mmol/L硼砂-硼酸（pH 9.0）為電泳緩沖溶液，分離電壓為25 kV，毛細管柱溫25℃，檢測波長254 nm。葛根素和大豆苷元濃度與峰面積分別在0.2～1.2 mg/mL和0.1～0.6mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限 （S/N＝3）分別為27.5 ng/mL和12.7 ng/mL，該方法簡便、快捷、靈敏，可用于葛根和腦得生片的快速常規(guī)檢測。

高效毛細管電泳；葛根素；大豆苷元；葛根；腦得生片

葛根是豆科植物葛的干燥根，具有解痙退熱、生津透疹和升陽止瀉的功效，用于外感發(fā)熱頭痛、項背強痛和熱痢等的治療[1]。葛根異黃酮為其有效成分，葛根中含有的兩種異黃酮葛根素和大豆苷元在臨床已用于治療藥物[2]。腦得生片收載于《中國藥典》2005年版一部，由三七、川芎、紅花、葛根和山楂5味中藥精制而成，具有活血化瘀、疏通經(jīng)絡(luò)、醒腦開竅之功效，用于腦動脈硬化、缺血性中風及腦出血后遺癥等病的治療。現(xiàn)代研究表明，葛根素和大豆苷元是治療心腦血管疾病的活性成分。對于葛根素和大豆苷元含量的測定方法，文獻中報道的有高效液相色譜法[3-5]、反相高效液相色譜法[6-11]、近紅外光譜法[12]、熒光光度法[13]、流動注射化學發(fā)光法[14]、薄層掃描法[15-16]等。腦得生片原質(zhì)量標準中無葛根素和大豆苷元的含量測定。本文采用HPCE法對葛根和腦得生片中葛根素和大豆苷元的含量進行了測定，此法具有分離效率高、分析速度快、操作成本低、試劑用量小等優(yōu)點，為進一步控制葛根及其制劑的質(zhì)量提供了科學依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

P/ACEMDQ型毛細管電泳儀、二極管陣列檢測器 （美國Beckman公司），融熔石英毛細管，AP250D電子天平（美國ohaus公司），PHS-25B酸度計（上海大中分析儀器廠），B3200S超聲波清洗器（上海必能信超聲有限公司），TFL-16C臺式高速離心機（菏澤石油化工學校儀器設(shè)備廠）。

硼砂、硼酸 （分析純，天津市化學試劑三廠），氫氧化鈉 （分析純，天津市北方天醫(yī)化學試劑廠），甲醇 （色譜純，天津市四友精細化學品有限公司），葛根素對照品、大豆苷元對照品（阿拉丁試劑公司），葛根（當?shù)厮幉氖袌觯X得生片（哈爾濱華雨制藥集團有限責任公司），實驗用水均為去離子水。

1.2 測試溶液的制備

1.2.1 對照品溶液的制備

稱定葛根素對照品10mg，大豆苷元對照品5mg，用甲醇分別定容成濃度為0.40mg/mL的葛根素對照品溶液和0.32 mg/mL的大豆苷元對照品溶液，備用。

1.2.2 樣品溶液的制備

稱取0.2 g葛根生藥粉置具塞瓶中，加甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，加甲醇補足質(zhì)量，高速離心 （12 000 r/min）10 min，取上清液作為樣品溶液。

取腦得生10片，除去糖衣，稱取0.5 g置具塞瓶中，加甲醇40mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30min，放冷，加甲醇補足質(zhì)量，高速離心（12 000 r/min）10min，取上清液作為樣品溶液。

1.3 操作條件

運行緩沖溶液：60 mmol/L硼砂-硼酸緩沖溶液，操作電壓25 kV，極性由正到負，檢測波長為254 nm，柱溫為25℃，采用壓力進樣，進樣時間為5 s。

毛細管沖洗方法：開機后用0.1mol/L氫氧化鈉溶液沖洗2min，水2min，運行緩沖溶液3 min。每次測定之間用運行緩沖溶液沖洗3min。

2 結(jié)果與討論

2.1 毛細管電泳分離條件的選擇

本實驗選用60mmol/L硼砂-硼酸緩沖溶液（pH 9.0）為運行緩沖液。因為在堿性溶液中硼酸會與葛根素中的鄰二醇羥基形成配合陰離子而增加溶解度，減少了因吸附造成的峰拖尾的影響。

實驗發(fā)現(xiàn)隨著分離電壓的升高，峰電流增大，遷移時間變短；隨著電壓降低，遷移時間延長，峰變寬，峰形變差。 綜合考慮分離度、噪音、焦耳熱、峰形及遷移時間等因素，選擇分離電壓為25 kV。

2.2 葛根素和大豆苷元的紫外吸收光譜

用二極管陣列檢測器在線檢測對照品和樣品中葛根素和大豆苷元在硼砂-硼酸緩沖溶液中的光譜，確定葛根素和大豆苷元在254 nm處均有最大吸收，故采用檢測波長254 nm。

2.3 方法的可行性

取混合對照品溶液、樣品溶液，在本實驗的操作條件下測得3種溶液的電泳圖譜，見圖1。

圖1 葛根（A），腦得生片（B）和對照品溶液（C）的電泳圖

2.4 回歸方程、線性范圍及檢出限

配制一系列不同濃度葛根素和大豆苷元的混合標準溶液，在選定的條件下測定，葛根素和大豆苷元濃度分別在0.2～1.2mg/mL和0.1～0.6mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程分別為y＝523 079 x＋266.18（葛根素，r＝0.999 5）和y＝598 369 x＋284.6 （大豆苷元，r＝0.999 4），其中y為峰面積，x為被測物濃度（mg/mL），r為回歸系數(shù)。葛根素和大豆苷元的檢出限（S/N＝3）分別為27.5 ng/mL和12.7 ng/mL。

2.5 加樣回收試驗

向已知含量的葛根及腦得生樣品中，加入葛根素和大豆苷元對照品，照樣品處理方法處理并測定，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收實驗結(jié)果

2.6 樣品含量測定結(jié)果

取不同批次的腦得生片及葛根，依法測定，結(jié)果見表2

表2 樣品含量測定結(jié)果

3 結(jié)論

本實驗用高效毛細管電泳法，配以二極管陣列檢測器測定葛根及其制劑腦得生片中葛根素和大豆苷元的含量，具有樣品處理簡單、靈敏度高、分辨率高、分析速度快、操作成本低及試劑用量小等優(yōu)點。為葛根藥材的真?zhèn)伪鎰e、品質(zhì)的鑒別及其制劑的質(zhì)控和檢驗提供了一種新方法。

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〔責任編輯 楊德兵〕

Determ ination of P uerarin and D aidzein in R adix P uerariae and N aodesheng T ablets by HPCE

LIU Li－zheng1，F(xiàn)ENG Feng1，2，SHUANG Shao－min1
（1.School of Chemical Engineering，ShanxiUaiversity，Taiyuan Shanxi，030006；2.School of Chemistry and Chemical Engineering，ShanxiDatong University，Datong Shanxi，037009）

A high performance capillary electrophoresis （HPCE）method with diode array detection was established for the determination the contents of puerarin and daidzein in radix puerariae and naodesheng tablets.An uncoated fused-silica capillary（57 cm×75μm，effective length 50 cm）was used.60mmol/L borax-borate buffer（pH 9.0）was used as a running buffer，the applied voltage was 25 kV，the capillary temperature was controlled at 25℃and the wavelength of detector was set at 254 nm.There is a good linear relationship between the peak areas and the concentration of the analytes in the range of 0.2～1.2mg·mL-1for puerarin and 0.1～0.6mg·mL-1for daidzein.the detection limit（S/N＝3）for puerarin and daidzein were 27.5 ng·mL-1and 12.7 ng·mL-1，respectively.the method was simple，rapid，accurate and can be used to control puerarin and daidzein in radix puerariae and naodesheng tablets.

h igh p erformance c apillary e lectrophoresis；Puerarin；Daidzein；Rradix pueraiae；Naodesheng t tablets

R914

A

1674－0874（2012）02－0028－04

2011-10-02

國家自然科學基金項目[21175085]

劉荔貞（1986－），女，山西大同人，碩士，研究方向：毛細管電泳。*馮鋒，博士，教授，通信作者。