血栓調節(jié)蛋白在糖尿病大鼠心肌中的表達及意義

張 雷 董志恒(北華大學基礎醫(yī)學院細胞生物教研室，吉林 吉林 3203)

糖尿病(DM)的慢性并發(fā)癥累及全身各個系統(tǒng)，其中糖尿病性心肌病(DCM)危害最大。研究顯示，長期的高血糖可引起各種組織蛋白非糖氧化，脂質堆積產生的大量中間產物和自由基誘發(fā)各級血管內皮損傷〔1〕。糖基化終末產物的形成促使多種細胞因子與生長因子的釋放與表達，增加血管內皮細胞通透性及單核細胞趨化性，加重了管壁炎癥反應和血管增生，引發(fā)了微循環(huán)障礙和心肌纖維細胞的增殖〔2〕。因此對于血管內皮細胞損傷及內皮細胞釋放的細胞因子的研究將為DCM的發(fā)病機制及防治提供可靠的理論依據(jù)，其意義重大。血栓調節(jié)蛋白(TM)是存在于內皮細胞表面的一類糖蛋白，對血管內凝血的調節(jié)起重要作用。在各種引起血管內皮損傷的病理情況下，由損傷的血管內皮細胞釋放TM，因此TM被認為是血管內皮細胞損傷的一個分子標志物〔3〕。國外有研究〔4〕提出血糖水平的波動與血管內皮損傷顯著相關，同時研究表明2型DM患者TM水平顯著升高，TM的水平與病情呈正相關〔5〕。國內學者研究發(fā)現(xiàn)〔6〕，TM在DM出現(xiàn)并發(fā)癥時顯著升高，隨病情進展，血管內皮損傷的加重，TM大量釋放入血，而凝血功能嚴重障礙加重了DM并發(fā)癥。雖然目前TM在DCM時的作用尚不清楚。基于以上所述，本實驗以TM為研究指標，通過觀察TM在DM大鼠心肌組織中的表達，初步探討其在DCM發(fā)生、發(fā)展過程中的可能作用，為進一步闡明DCM發(fā)病機制提供理論依據(jù)和防治的新靶標。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用普通級、健康SD雄性大鼠50只，6周齡，體重(220±20)g，由吉林大學動物實驗中心提供。大鼠精神狀態(tài)良好，反應靈敏，皮毛光澤，飲食正常。大鼠在通風及光線良好、環(huán)境衛(wèi)生、溫濕度適宜的飼養(yǎng)環(huán)境下適應性喂養(yǎng)1 w后，進入實驗。實驗期間動物飼料為鼠用常規(guī)飼料。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 鏈脲佐菌素(STZ)為美國Sigma公司產品。樂康全血糖檢測儀及試紙條為德國羅氏診斷公司生產。血糖高靈敏度試劑盒采用長春匯力生物工程技術開發(fā)中心生產的試劑盒。Whatman PCR擴增儀為德國產品。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。免疫試劑盒為北京中杉生物技術公司提供。逆轉錄酶試劑盒由Invitrogen公司生產。DNA Marker(DL-2000)由Takara公司提供。

1.2.2 模型的制備與分組 50只健康SD雄性大鼠適應性喂養(yǎng)1 w后隨機分為正常對照組(C組)及糖尿病組(DM組)，其中C組18只，DM組32只。DM組大鼠禁食 12 h后，按55 mg/kg一次性腹腔注射 STZ溶液(臨用前用0.1 mol/L、pH4.2枸櫞酸緩沖液溶解)，C組腹腔注射等量0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液。72 h后測定空腹血糖及尿糖定性，空腹血糖≥16.7 mmol/L，尿糖定性≥，動物多飲、多食、多尿者確定為DM模型。造模完成后，除去造模失敗及死亡大鼠共20只造模成功大鼠完成實驗。分別于2、8、12 w末將大鼠分批處死:2 w末(模型組7只、正常組6只);8 w末(模型組7只、正常組6只);12 w末(模型組6只、正常組6只)。每日觀察大鼠進食、飲水、毛色等一般情況，每周固定時間測量體重、血糖、尿糖。

1.2.3 標本采集及制備

1.2.3.1 光鏡標本 分別在2、8、12 w末進行標本收集。在標本收集前兩組大鼠禁食、禁水12 h，處死前稱體重。所有大鼠乙醚麻醉處死，眶后靜脈采血后，開胸取心臟，用生理鹽水清洗吸干稱重后，將留取的光鏡標本立即置入10%中性甲醛液固定48 h，常規(guī)制備石蠟切片。連續(xù)4 μm切片，進行HE、PAS及免疫組化染色。

1.2.3.2 電鏡標本 將留取的小塊心肌在0.2 mol/L二甲砷酸鈉緩沖液(pH7.4，含2.5%戊二醛)中細切，4%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定1 h，包埋、聚合后制備成超薄切片，電子染色，透射電鏡觀察心肌超微結構，攝片。

1.2.4 血糖及血脂測定 采用葡萄糖氧化酶法測定血糖;采用日立7150型自動生化分析儀測定血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)含量。

1.2.5 心臟指數(shù) 將兩組大鼠心臟稱重。計算公式如下:心臟指數(shù)=心臟重量/體重。

1.2.6 TM mRNA測定 取速凍大鼠心肌組織約100 mg，按Trizol試劑說明書方法提取心肌組織總RNA。取其中1 μg，進行RT-PCR反應。TM引物序列分別為:上游5'-CGGCTTCCAGTGGGTTAC-3';下游 5'-TTCCCGAGTCCAGTGTCT-3'，擴增產物片段長度為401 bp。同時擴增β-actin，其引物序列分別為:上游 5'-ACAACCGTCATCGCCCACAT-3';下游 5'-ACTTCCCTGACCTTGCTAGT-3'，擴增產物片段長度為540 bp。PCR變性、退火和延伸溫度分別為94℃、55℃和72℃，反應時間分別為45、45和60 s，共進行30個循環(huán)。循環(huán)完畢再72℃ 延伸10 min。PCR產物用2%瓊脂凝膠電泳分析，電泳后在紫外燈下拍攝照片，然后用凝膠成像處理系統(tǒng)對每一標本的PCR產物擴增的特異性片段進行灰度掃描，以β-actin密度作為參考定量標準，數(shù)值以兩者之積分吸光度的比值表示，以對照組的比值作為標準1.0。

2 結果

2.1 一般狀態(tài)及心臟指數(shù)

2.1.1 大鼠一般情況觀察 正常對照組大鼠精神狀況良好，毛色白、有光澤，反應靈敏、動作自如，飲食水正常，實驗期間未有死亡。模型組大鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡，多飲、多食、多尿等典型糖尿病癥狀。前期(2 w)模型組與正常組相比飲水量并無明顯變化，后期(8、12 w)模型組每只大鼠每天飲水量多于120 ml，每天需換墊料一兩次。模型組早期多動，后期反應遲鈍，動作遲緩，弓背曲體，毛豎無光澤，部分出現(xiàn)爛尾、爛趾、白內障等癥狀。整個實驗過程中3只大鼠造模失敗被淘汰，9只模型組大鼠(1 w 3只，4 w 1只，11 w 2只，12 w 3只)死亡。

2.1.2 大鼠心臟指數(shù)變化 與相應C組相比，2 w末DM組大鼠心臟指數(shù)無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);8、12 w末DM組大鼠心臟指數(shù)明顯增加(P＜0.01)。與2 w末DM組大鼠比較，8、12 w末DM組大鼠心臟指數(shù)差異顯著(P＜0.01)。12 w末與8 w末DM組相比，心臟指數(shù)顯著增加(P＜0.01)。上述結果提示，8、12 w末DM組大鼠已經出現(xiàn)心肌纖維化，心肌肥厚，見表1。

表1 各時段各組大鼠心重、體重、心臟指數(shù)比較(±s)

表1 各時段各組大鼠心重、體重、心臟指數(shù)比較(±s)

與相應C組比較:1)P＜0.01;與2 w末DM組比較:2)P＜0.01;與8 w末DM組比較:3)P＜0.01

組別 n 心重(g) 體重(g)心臟指數(shù)C2 6 1.21±0.02 224.22±3.03 2.74 ±0.03 C8 6 1.36±0.03 243.13±2.46 2.73±0.02 C12 6 1.52±0.02 266.31±3.14 2.75±0.03 DM2 7 1.21±0.02 228.06±6.01 2.74±0.03 DM8 7 1.06±0.031)2) 184.80±4.741)2) 3.80±0.451)2)DM12 6 0.79±0.031)2)3)164.00±1.671)2)3)4.22±0.271)2)3)

2.2 大鼠生化指標的變化 與C組比較，DM組血糖、血清TC、TG、LDL均顯著升高，而HDL降低(P＜0.01)，提示DM 組大鼠伴有明顯的糖、脂代謝紊亂，見表2。

2.3 形態(tài)學觀察

2.3.1 HE染色顯示 正常對照組大鼠心肌細胞排列整齊，橫紋清晰，細胞核呈橢圓形，大小均一，位于中央，胞漿染色均勻，閏盤未見異常。2 w末模型組未見明顯病理改變。8、12 w末模型組心肌細胞肥大、排列紊亂，胞漿疏松化，細胞核大小不甚規(guī)則，細胞外間質增多。8 w末較12 w末病理變化略輕。

2.3.2 電鏡下 正常對照組大鼠心肌細胞排列整齊，細胞連接清晰，肌絲排列規(guī)整，明暗帶清晰;細胞核呈卵圓形，核仁清晰可見;線粒體結構清晰，異染色質成簇狀聚集，細胞間質可見少量膠原纖維。2 w末模型組未見明顯病理變化。8、12 w末模型組心肌細胞排列紊亂，肌絲溶解、斷裂、稀疏，線粒體腫脹、變形，嵴排列紊亂，部分線粒體破裂，肌漿網擴張，閏盤扭曲模糊斷裂，間質可見大量膠原纖維分布;8 w末電鏡病變較12 w為輕，見圖1。

2.4 TM蛋白表達 免疫組化顯示，正常對照組心肌細胞內可見少量稀疏的淺棕色顆粒，主要定位于胞質，呈弱陽性表達。模型組陽性表達明顯增多，其中2 w末可見細顆粒狀棕黃顆粒彌散分布于部分心肌細胞胞質內;8、12 w末胞質內可見濃密的深棕色顆粒;統(tǒng)計分析顯示模型組間陽性表達由低到高順序依次是 2、8 和12 w 末，見表3，圖2。

表2 各時段各組大鼠血糖、TC、TG、LDL、HDL比較(±s，mmol/L)

表2 各時段各組大鼠血糖、TC、TG、LDL、HDL比較(±s，mmol/L)

與C組比較:1)P＜0.01;與DM2組比較:2)P＜0.01，3)P＜0.05;與DM8組比較:4)P＜0.01，5)P＜0.05

組別 n 血糖TC TG LDL HDL C2 6 5.19±0.64 4.71±0.55 1.11±0.29 2.31±0.581.36±0.13 C8 6 5.21±0.65 5.02±0.78 1.15±0.23 2.08±0.62 1.39±0.14 C12 6 5.20±0.64 4.53±0.64 1.28±0.24 2.28±0.67 1.45±0.18 DM2 7 18.19±0.951) 6.00±0.241) 1.87±0.041) 3.87±0.381) 0.85±0.041)DM8 7 21.54±0.811)2) 6.57±0.421)3) 2.09±0.151)3) 4.46±0.211)3) 0.70±0.061)3)DM2 6 27.62±1.921)2)4) 8.15±0.221)2)4) 2.50±0.101)2)3) 5.10±0.101)2)5) 0.56±0.091)2)5)

圖1 各組大鼠心肌組織超微結構變化(×10 000)

圖2 各組大鼠心肌組織TM免疫組化染色(×400)

圖3 大鼠心肌組織TM mRNA的PCR的電泳圖

2.5 TM mRNA表達 與正常對照組相比，2、8、12 w末模型組心肌組織TM mRNA表達明顯增高(P＜0.01);隨病程發(fā)展，TM mRNA表達由低到高順序依次為2、8、12 w末，見表3，圖3。

表3 各時段各組大鼠心肌組織TM蛋白及mRNA表達(±s)

表3 各時段各組大鼠心肌組織TM蛋白及mRNA表達(±s)

與C組比較:1)P＜0.01;與DM2組比較:2)P＜0.01，3)P＜0.05;與DM8組比較:4)P＜0.01

組別 n TM蛋白TM mRNA C2 6 1.84±0.08 0.26±0.01 C8 6 1.84±0.09 0.25±0.02 C12 6 1.85±0.09 0.24±0.01 DM2 7 4.83±0.051) 0.36±0.021)DM8 7 8.42±0.261)2) 0.38±0.021)3)DM12 6 15.52±0.151)2)4) 0.44±0.011)2)4)

3 討論

DCM主要病理改變?yōu)樾募〖毎蚀?、凋亡，心肌間質纖維化，心肌微循環(huán)障礙及心肌間質重構。長期高血糖所誘發(fā)的血管內皮損傷促使各種細胞因子的釋放，引發(fā)了微循環(huán)障礙和心肌細胞的增殖，在DCM的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

張芳林等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)糖尿病SD大鼠成模8 w后心肌細胞凋亡、心臟舒張功能受損，提示糖尿病動物及患者早期即可發(fā)生心肌損傷。本研究通過測量STZ誘導的糖尿病大鼠心臟重量，并計算心臟指數(shù)發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠8、12 w末心臟指數(shù)顯著高于正常對照組。HE染色及電鏡下顯示，8、12 w末模型組均有心肌細胞肥大、排列紊亂，胞漿疏松樣變，肌纖維排列紊亂、斷裂、溶解，線粒體腫脹、變形，嵴排列紊亂，部分線粒體破裂，肌漿網擴張，間質內大量膠原纖維分布等病理變化，上述結果與穆松?！?〕、黃昶荃等〔9〕研究相一致，證實了DCM 的存在。

TM是血管內皮細胞的膜表面發(fā)現(xiàn)的一種糖蛋白，廣泛分布在除中樞神經系統(tǒng)和肝竇外人體各組織器官的動、靜脈、毛細血管及淋巴管內皮細胞內，血管內皮細胞受損時，TM脫落釋放入血，參與調節(jié)血管緊張度與免疫反應〔10，11〕。大量研究發(fā)現(xiàn)〔12～15〕，DM時高血糖能直接抑制血管內皮細胞DNA合成，影響內皮細胞更新。慢性高血糖狀態(tài)下，內皮細胞膜功能蛋白的非酶糖基化使細胞膜受損，高糖至局部血流淤滯，組織缺氧，自由基損傷內皮。此外，山梨醇代謝亢進、血管舒縮因子的不平衡及內皮細胞表面黏附因子增加等因素協(xié)同作用導致了糖尿病內皮損傷，而損傷的血管內皮細胞釋放大量TM入血〔16〕。進一步研究發(fā)現(xiàn)〔17，18〕，DM時細胞膜上TM的植物血凝素被降解，細胞之間的信號途徑被激活，有絲分裂原活化的蛋白激酶被磷酸化，細胞間黏附分子-1表達增加，促進白細胞黏附到內皮細胞表面，使白細胞運動停滯，引起毛細血管阻塞，內皮細胞功能失調，毛細血管無灌注和血管滲漏，導致組織循環(huán)淤滯和局部缺氧，最終微血管通透性增加和新生血管生成。本研究結果提示TM水平反映了DCM心肌血管病變程度，且與DCM的心肌病變呈正相關。結合上述研究結果進一步發(fā)現(xiàn)推測，TM在DCM心肌組織中的表達很有可能是DM時，高血糖引起的血管內皮細胞損傷使其脫落于細胞膜表面，并因微血管通透性增加、新血管形成等因素進入心肌細胞間質中，從而參與DCM的發(fā)生發(fā)展。

總之，DM心肌組織中TM表達狀況可部分反映DCM發(fā)生及其嚴重程度，進一步深入研究其在體內的代謝和生理功能，可有利于解釋DM心肌病變危險性增加的原因，這對探討DCM的發(fā)病機制提供了新的靶向，對指導DCM的防治也有著極其重要的理論和臨床意義。

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