金屬蛋白酶-9和腫瘤壞死因子在子宮內(nèi)膜異位癥的表達(dá)

張紅娟，何康玲，王 莉

金屬蛋白酶-9和腫瘤壞死因子在子宮內(nèi)膜異位癥的表達(dá)

張紅娟，何康玲，王 莉

子宮內(nèi)膜異位癥（EM）；基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）；腫瘤壞死因子（TNF）

具有生長功能的子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮腔被覆黏膜以外的身體其他部位時稱為子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EM）。EM是一種具有惡性侵襲行為的良性婦科疾病，主要的臨床表現(xiàn)為痛經(jīng)、盆腔包塊和不孕等，近年發(fā)病率不斷上升，嚴(yán)重影響婦女的生殖健康及生活質(zhì)量。其發(fā)生機(jī)制至今尚不清楚，故引起研究者的廣泛關(guān)注，并成為當(dāng)今一個研究熱點(diǎn)。已有大量研究報道，免疫系統(tǒng)的變化，包括各種免疫球蛋白、細(xì)胞因子（CK）、整合素家族等均參與了EM的發(fā)病過程，并起著關(guān)鍵作用。腫瘤壞死因子（TNF）能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮生成因子 （VEGF）的生成，基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-3）能降解細(xì)胞外基質(zhì)ECM（extra cellular matrix，ECM）。本研究通過測定EM患者血清中的MMP-9、TNF及異位和在位內(nèi)膜中MMP-9的表達(dá)，探討TNF與MMP-9在EM發(fā)病機(jī)制中的相關(guān)性，為治療EM提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2009-01～2011-10因EM在筆者所在醫(yī)院婦產(chǎn)科行腹腔鏡手術(shù)的患者32例作為試驗組，年齡21～45歲，平均37.18歲；均取在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜灶，分為在位內(nèi)膜組與異位內(nèi)膜組。選取同期因子宮肌瘤切除子宮或單純肌瘤剔除患者的子宮內(nèi)膜32例作為對照組，年齡27～49歲，平均40.31歲。所取標(biāo)本經(jīng)中性甲醛液固定后石蠟包埋，待用。同時抽取試驗組和對照組患者術(shù)前清晨空腹靜脈血5 ml，自然凝固，臺式離心儀2500 r/min，5 min分離血清，貯存于-80℃冰箱中，待測。研究對象術(shù)前3個月內(nèi)均未用激素治療，術(shù)后組織病理學(xué)檢查證實(shí)為EM和子宮平滑肌瘤。

1.2 方法 取異位內(nèi)膜組在位子宮內(nèi)膜和異位內(nèi)膜標(biāo)本，以及對照組的子宮內(nèi)膜，放入多聚甲醛（10%PF）固定液于4℃冰箱中固定24～48 h。組織經(jīng)過沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、修塊、切片后烤干備用（光鏡和免疫組織化學(xué)）。每個標(biāo)本取1張切片用HE染色，進(jìn)行組織結(jié)構(gòu)的觀察。所有標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，脫水，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片備用，采用免疫組化SABC法檢測篩選標(biāo)本中MMP-9，一抗及SABC試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司，一抗為鼠抗人MMP-9單克隆抗體，主要操作步驟如下：用3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化酶20 min；于98℃下微波修復(fù)抗原，4℃孵育過夜后，加正常羊血清封閉20 min；滴加一抗MMP-9抗體稀釋后的質(zhì)量濃度分別為1∶100和1∶100滴加二抗；室溫放置10 min，滴加試劑SABC；10 min后DAB染色5 min；蘇木素復(fù)染。血清中MMP-9、TN含量的測定采用ELISA法，嚴(yán)格按試劑盒說明的實(shí)驗步驟檢測。

1.3 結(jié)果判定 光學(xué)顯微鏡下觀察組織切片細(xì)胞胞漿、基質(zhì)的顯色反應(yīng)，MMP-9陽性信號均呈棕黃色或棕褐色。利用全自動病理圖像分析儀及圖像分析軟件對切片進(jìn)行分析，每張切片隨機(jī)選取5個視野，以平均光密度 （mean optical density，MOD，MOD=有效測量面積范圍內(nèi)目標(biāo)染色區(qū)累積光密度值/有效測量區(qū)域面積）表示MMP-9表達(dá)強(qiáng)度，每次閱片前校正光密度，閱片時保持每張切片光線、白平衡等參數(shù)不變。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者血清中MMP-9、TNF含量 試驗組患者血清中MMP-9、TNF含量明顯高于對照組（P<0.01），見表1。

表1 試驗組和對照組患者血清中MMP-3、TNF的含量

表1 試驗組和對照組患者血清中MMP-3、TNF的含量

與對照組比較，*P<0.01

MMP-3（ng/ml） TNF（pg/ml）34.472±5.447*19.629±5.493*2.977±1.201 12.527±3.529分組 n試驗組 32對照組 32

2.2 MMP-9在不同內(nèi)膜組織中的表達(dá) 在各組子宮內(nèi)膜組織中，MMP-9陽性信號主要位于組織的腺體上皮細(xì)胞，部分位于間質(zhì)中。MMP-9在異位和在位內(nèi)膜組中的表達(dá)均無顯著性差異（P＞0.05），但均高于對照組（P＜0.05），見表2。

表2 MMP-9在各組子宮內(nèi)膜中的表達(dá)（MOD，

表2 MMP-9在各組子宮內(nèi)膜中的表達(dá)（MOD，

與在位內(nèi)膜組比較，*P＞0.05，與異位和在位內(nèi)膜組比較，#P＜0.05

MMP-9 0.32±0.09 0.34±0.09*0.26±0.04#分組 n試驗組在位內(nèi)膜組 32異位內(nèi)膜組 32對照組 32

3 討 論

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是鋅依賴性的蛋白酶家族，是惡性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移與浸潤的一種重要介質(zhì)。目前已證明EM患者子宮的在位和異位內(nèi)膜均可分泌MMPs，并在EM的發(fā)病過程中具有重要作用。MMPs可以降解ECM和基底膜的所有成分，依其降解底物的不同可分為6型約19種。MMP-9是MMPs家族中相對分子質(zhì)量最大的明膠酶，能降解ECMⅣ、Ⅴ型膠原和明膠等主要成分，并能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長，導(dǎo)致新生血管的形成，同時可通過與整合素的相互活化而加強(qiáng)細(xì)胞間的粘附作用，從而在子宮內(nèi)膜細(xì)胞的異位粘附、種植、生長的過程發(fā)揮重要作用[1]。本文結(jié)果顯示，MMP-9在異位和在位內(nèi)膜組織中的表達(dá)顯著高于對照組，說明異位和在位內(nèi)膜組織中MMP-9的過度表達(dá)可能使異位和在位內(nèi)膜具有很強(qiáng)的侵襲種植能力。

TNF是一類具有多種生物活性的細(xì)胞因子，是由激活的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生的高效能的細(xì)胞因子，一方面是機(jī)體免疫保護(hù)的重要介質(zhì)，另一方面可參與機(jī)體的免疫病理損傷[1]。本文結(jié)果表明，EM患者血清中的TNF的含量明顯高于正常對照組，可能系腹腔液內(nèi)存在大量的TNF入血所致，也可能與EM患者外周血單核細(xì)胞活性增強(qiáng)，免疫防御功能受到破壞，導(dǎo)致機(jī)體的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)系統(tǒng)紊亂，過量的TNF不僅可以抑制IgG和IgM的產(chǎn)生，而且還影響某些克隆T細(xì)胞的分化，使T淋巴細(xì)胞不能發(fā)揮正常的免疫反應(yīng)所致[2]。TNF-α通過介導(dǎo)炎癥和免疫反應(yīng)，使多種細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，促進(jìn)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞生長和分泌VEGF（血管內(nèi)皮生成因子）。TNF可能誘導(dǎo)腹腔間皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，使內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞粘附在腹腔間皮細(xì)胞，同時TNF通過促進(jìn)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞生長和分泌VEGF，使異位內(nèi)膜基底部毛細(xì)血管的數(shù)量和面積增多，有利于內(nèi)膜的種植、生長，向組織深部浸潤。

研究認(rèn)為TNF、血管內(nèi)皮生長因子等細(xì)胞因子又可促進(jìn)MMP的合成，從而在細(xì)胞粘附、種植、新生血管的形成、組織纖維化和機(jī)體免疫機(jī)制中起到非常重要的作用[3-7]。正是由于多種細(xì)胞因子與肥大細(xì)胞的相互作用、相互影響形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，共同促進(jìn)了EM的形成和發(fā)展。本文結(jié)果也顯示，EM患者血清中的MMP-9和TNF同時升高，一方面TNF通過自身炎性細(xì)胞因子的作用加速EM的發(fā)生發(fā)展，誘導(dǎo)腹腔間皮細(xì)胞表達(dá)粘附分子，使內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞粘附在腹腔間皮細(xì)胞，促進(jìn)內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的生長和VEGF的分泌；另一方面，通過誘導(dǎo)MMP-9的分泌，增強(qiáng)異位內(nèi)膜對ECM水解破壞和促進(jìn)異位灶新生血管的形成，協(xié)同促進(jìn)了EM的發(fā)生發(fā)展。

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[2012-02-27收稿，2012-03-20修回]

[本文編輯：宋 敏]

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R711.71

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450007河南鄭州，153醫(yī)院婦產(chǎn)科（張紅娟，何康玲，王莉）