膜聯(lián)蛋白A2在肝癌患者外周血中的表達研究

劉海潮，張水軍，郭文治

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽胰外科 河南鄭州 450052)

肝癌是成年人最常見的肝臟惡性腫瘤;其發(fā)病率和死亡率及惡性程度極高［1］，我國是肝癌發(fā)病大國，高發(fā)年齡40～50歲，由于起病隱匿(40%診斷時沒有癥狀)，因此早期診斷率和5年生存率低［2］，而肝癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移是肝癌治療的主要障礙，目前尚沒有一個可靠的腫瘤標(biāo)記物能夠預(yù)測肝癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。近年來的研究表明［3］，膜聯(lián)蛋白A2的表達水平在腫瘤組織中有顯著變化，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，已有研究表明，ANXA2在肝癌組織中高度表達［4］，而在血清中的表達水平尚未報道。本研究通過酶聯(lián)免疫吸附試驗對ANXA2在肝癌病人外周血中的含量進行檢測，探討其在肝癌進展和轉(zhuǎn)移中的作用，為肝癌的診治提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 研究對象 選取鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科2011年07月至2012年10月的肝癌病人64例，肝硬化病人78例，同時選取鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院輸血科正常人的血清標(biāo)本40例。入選標(biāo)準(zhǔn):①肝癌病人均經(jīng)手術(shù)治療，且術(shù)后病理證實為肝細胞肝癌;②肝硬化病人均經(jīng)相關(guān)檢驗、影像學(xué)檢查確診;③肝癌患者術(shù)前未經(jīng)放療、化療或其他抗癌治療;④肝癌病人術(shù)后至少隨訪6個月，半年內(nèi)無失訪、死亡，隨訪資料完整。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會通過。

1.2 標(biāo)本 患者于入院第1天空腹抽取靜脈血，正常人血清直接從血庫取得，血標(biāo)本經(jīng)2 000 r/min離心15 min，取上清液分裝于無菌干燥EP管，－20℃凍存。

1.3 方法 采用ELISA雙抗體夾心法測定血清中ANXA2的表達水，ELISA試劑盒購自美國R＆D公司。在經(jīng)人ANXA2抗體包被的酶免反應(yīng)孔中分別加入稀釋血清樣本、標(biāo)準(zhǔn)品及測定用空白試劑(樣品稀釋液)，然后分別加入由HRP(辣根過氧化物酶)結(jié)合的ANXA2抗體，37℃溫育30 min后棄去孔內(nèi)液體，加入洗滌液洗滌，再加入酶標(biāo)試劑37℃反應(yīng)30 min，洗滌后加入顯色劑顯色10 min，再加入終止液終止酶顯色反應(yīng)。在酶免分析儀上以空白孔為零，測量波長450 nm，讀取各孔的吸光度(OD值)，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算ANXA2含量，結(jié)果以ng/ml表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，定量資料的比較采用t檢驗、秩和檢驗或單因素方差分析，α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 ANXA2表達結(jié)果 64例肝癌病人血清中ANXA2 的平均濃度為(36.21 ±13.50)ng/ml，78 例肝硬化病人中 ANXA2的平均濃度為(25.68±11.54)ng/ml，在正常對照組的40例病人中，ANXA2平均濃度為(21.09 ±6.86)ng/ml，肝癌組與肝硬化組、正常對照組比較，ANXA2平均濃度明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，同樣，肝硬化組ANXA2平均濃度高于正常對照組(P＜0.05)。見表1。

表1 肝癌、肝硬化及正常人外周血中ANXA2的平均濃度(ng/ml)

2.2 肝癌患者血清ANXA2、AFP水平相關(guān)性分析64例肝癌患者血清ANXA2的平均濃度為(36.21±13.50)ng/ml，AFP 為(507.22 ± 327.50)ng/ml，經(jīng)Pearson相關(guān)分析，ANXA2與AFP之間并無相關(guān)關(guān)系(r=0.077，P=0.546)。

2.3 ANXA2在血清中的表達與肝癌臨床病理特征的聯(lián)系 不同性別、年齡段的病人血清中ANXA2的水平無明顯差異(P＞0.05)，但AFP值大于400、腫瘤直徑大于5 cm、腫瘤分化程度較低、發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移以及感染乙肝病毒的病人，ANXA2的血清水平明顯升高(P ＜0.05)，見表2。

表2 ANXA2在血清中的表達與肝癌臨床病理特征的聯(lián)系

3 討論

膜聯(lián)蛋白A2(annexin A2，ANXA2)是一種鈣離子介導(dǎo)的磷脂結(jié)合特性的蛋白質(zhì)，屬于膜聯(lián)蛋白家族成員，廣泛分布于胞核、胞漿及細胞質(zhì)膜外表面［3］。ANXA2在細胞內(nèi)參與膜形成、膜轉(zhuǎn)運、胞吞、胞吐、細胞增殖、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、分化及凋亡等一系列重要的生命過程。近年來的研究表明［5］，ANXA2與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，ANXA2的上調(diào)與肝癌，結(jié)直腸癌、乳腺癌、胰腺癌、急性早幼粒細胞白血病和腎細胞癌關(guān)系密切，而ANXA2下調(diào)與前列腺癌、食管鱗狀癌、鼻咽癌和鼻竇腺癌有關(guān)，ANXA2可能被用來作為一個潛在的生物標(biāo)志物對某些腫瘤的診斷、治療和預(yù)后。

Zhang等［6］通過對肝癌組織及血清中檢測ANXA2發(fā)現(xiàn)，ANXA2表達定位于肝癌組織的細胞膜和細胞質(zhì)中，肝癌患者組織和血清中ANXA2的表達顯著高于非肝癌病人，并且與HBV感染呈正相關(guān)，這與本研究結(jié)果相吻合。本研究結(jié)果顯示，ANXA2在肝癌病人外周血中的含量明顯高于肝硬化病人及正常人，而肝硬化病人中ANXA2的血清水平高于正常人，可能與肝硬化病人大多感染HBV有關(guān);肝癌病人中，AFP值較高、分化程度較低、腫瘤直徑較大、HBV感染以及發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移者，ANXA2在血清中的含量顯著升高，這進一步證實了ANXA2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，豐富了ANXA2在肝臟腫瘤中的研究，為肝癌的早期診斷和預(yù)測復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移提供新的思路。本研究提示，ANXA2的高表達可能是肝癌產(chǎn)生的原因之一，檢測ANXA2的含量將有助于肝癌的診斷，通過檢測ANXA2的表達將對預(yù)測肝癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移有幫助，ANXA2可能成為肝癌治療的潛在靶點。但本研究尚待多中心、大樣本的研究加以驗證。

［1］ 吳鵬飛.抑癌基因p53與原發(fā)性肝癌的研究進展［J］.河南醫(yī)學(xué)研究，2010，19(3):374-377.

［2］ 郝寶嵐，王艷，呂毅，等.血小板和冷沉淀在肝臟及其它外科手術(shù)中的聯(lián)合輸注［J］.河南醫(yī)學(xué)研究，2011，20(2):244-246.

［3］ 章藹然，潘寧，侯穎春，等.膜聯(lián)蛋白A2與惡性腫瘤發(fā)展進程的關(guān)系［J］.細胞生物學(xué)雜志，2008，30(3):307-311.

［4］ 張海健，秦呈林，姚寧華，等.肝癌組織膜聯(lián)蛋白A2異常表達及臨床病理特征分析［J］.南通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2012，32(2):110-113.

［5］ Zhang X，Liu S，Guo C，et al.The association of annexin A2 and cancers［J］.Clin Transl Oncol，2012，14(9):634-640.

［6］ Zhang H J，Yao D F.Expression characteristics and diagnostic value of annexin A2 in hepatocellular carcinoma［J］.World J Gastroenterol，2012，18(41):5897-5904.