應(yīng)用熒光偏振檢測方法對出口牛進行布氏桿菌病檢測

王玉玲，柴銘駿，劉紅梅

（天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心，天津塘沽 300461）

布氏桿菌?。˙rucellosis）（又稱布魯氏菌病）是由布氏桿菌（Brucella）引起的人獸共患傳染病，其特征是生殖器官和胎膜發(fā)炎，引起流產(chǎn)、不育和各種組織的局部病灶。布氏桿菌病在牛、羊、豬等家畜中最常發(fā)生。本病很容易傳播給人，引起一種波浪熱的急性發(fā)熱性疾病，也可以發(fā)展成慢性，引起肌肉、骨骼、心血管系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的嚴重并發(fā)癥。

布氏桿菌病可通過口腔、呼吸道、結(jié)膜炎或其他可能的途徑，通常是職業(yè)性接觸而被感染，攝入感染的奶制品是對公共衛(wèi)生的主要危險。同時本病亦可由牛、羊、豬傳染于其它家畜。由于布氏桿菌病對公共衛(wèi)生的意義極大，對畜群的危害大，且廣泛分布于世界各地，可引起不同程度的流行，給畜牧業(yè)和人類的健康帶來嚴重危害，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為一種對國際貿(mào)易有重要影響的疫病[1]，我國農(nóng)業(yè)部將其列為二類動物疫病，并將其列為進境動物二類傳染病[2]。

布氏桿菌病主要依靠實驗室檢測結(jié)果并結(jié)合流行病學(xué)進行確診。目前常用的檢測方法有平板凝集、試管凝集、補體結(jié)合和酶聯(lián)免疫吸附試驗。熒光偏振檢測方法（FPA）是一種新的試驗方法，本文應(yīng)用FPA對我國出口哈薩克斯坦的牛進行布氏桿菌病檢測，同時用補體結(jié)合試驗（CFT）、平板凝集試驗（RBPT）、試管凝集試驗（SAT）、間接ELISA（iELISA）、競爭ELISA（cELISA）進行檢測方法的比對，現(xiàn)將檢測情況報告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 布氏桿菌病虎紅平板凝集抗原、試管凝集抗原、補體結(jié)合抗原、補體、溶血素、標(biāo)準陽性血清、標(biāo)準陰性血清均購自中國獸藥監(jiān)察所，布氏桿菌病間接ELISA、競爭ELISA試劑盒購自北京測迪公司，布氏桿菌病熒光偏振試劑盒購自美國。

1.1.2 血清樣品 采自出口哈薩克斯坦牛的321份血清樣品。

1.2 方法

1.2.1 虎紅平板凝集試驗、試管凝集試驗、補體結(jié)合試驗按出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準SN/T1088-2010進行。

1.2.2 間接ELISA試驗、競爭ELISA試驗方法按試劑盒使用說明書進行。

1.2.3 熒光偏振檢測方法 取20 μL血清樣品加入黑色96孔微量反應(yīng)板內(nèi)，加180 μL反應(yīng)緩沖液，室溫孵育3 min，置熒光偏振儀上讀板，加結(jié)合物10 μL，室溫孵育2 min，置熒光偏振儀上讀板，兩次讀取值的差值與陰性對照的差值進行比較，判定陰陽性結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 熒光偏振試驗 321份血清樣品中有25份樣品為FPA試驗陽性反應(yīng)（見表1）。

2.2 虎紅平板凝集試驗 321份血清樣品中有17份樣品為平板凝集試驗陽性反應(yīng)（見表1）。

2.3 試管凝集試驗 321份血清樣品中有18份樣品為試管凝集試驗陽性反應(yīng)（見表1）。

2.4 補體結(jié)合試驗 321份血清樣品中有10份樣品為補體結(jié)合試驗陽性反應(yīng)（見表1）。

2.5 間接ELISA試驗 321份血清樣品中有21份樣品為iELISA試驗陽性反應(yīng)（見表1）。

2.6 競爭ELISA試驗 321份血清樣品中有26份樣品為cELISA試驗陽性反應(yīng)（見表1）。

表1 六種血清學(xué)方法檢測牛布氏桿菌病的陽性結(jié)果比對

3 討論

3.1 FPA的原理是溶液中的分子作隨機轉(zhuǎn)動，分子的大小是影響轉(zhuǎn)動速率的主要因素，與其成反比關(guān)系，因而小分子較大分子轉(zhuǎn)動得快。如果給分子標(biāo)記上熒光色素，通過一定角度的轉(zhuǎn)動時間即可通過測量水平和垂直的偏振光強度來確定。因而大分子比轉(zhuǎn)動快的小分子發(fā)射更多的偏振光。

一般以分子量小于50KD的抗原用熒光素標(biāo)記，熒光標(biāo)記的小分子抗原在溶液中旋轉(zhuǎn)速度快，熒光偏振光強度小。當(dāng)加入被檢血清或全血時，熒光標(biāo)記的小分子抗原與其相應(yīng)抗體結(jié)合后，所形成的大分子在溶液中旋轉(zhuǎn)速度變慢，熒光偏振光強度增大。通過熒光偏振儀測量，將獲得的偏振光差值與陰性對照偏振值比較，即可判定出樣品的陰陽性。

3.2 以兩種試驗方法檢測為陽性的樣品即認定該樣品為陽性的規(guī)則看，SAT有1份樣品為假陽性，F(xiàn)PA未出現(xiàn)假陽性，說明FPA的特異性較高；用RBPT、SAT（假陽性除外）、CFT、iELISA方法檢測為陽性的樣品，用FPA方法均能檢測為陽性，而用RBPT、SAT、CFT、iELISA不能檢測出陽性的樣品，用FPA仍能檢測出陽性，說明FPA的敏感性也較高。FPA的檢測結(jié)果與cELISA結(jié)果最接近，說明FPA敏感性和特異性接近于cELISA。

3.3 FPA方法簡便快速，可在15分鐘內(nèi)完成92份樣品的布氏桿菌病檢測，不需要象ELISA那樣的洗板步驟。

目前在國際貿(mào)易中，在雙邊簽訂的檢疫議定書中，對于牛、豬、羊的布氏桿菌病檢測主要采用的方法為RBPT、SAT、CFT[2]；FPA從敏感性和特異性上都優(yōu)于或等于目前主要采用的RBPT、SAT、CFT、ELISA檢測方法。不論從檢測方法的簡便快速上，還是從敏感性和特異性上看，F(xiàn)PA試驗都是一個較為理想的、可靠的檢測布氏桿菌病抗體的血清學(xué)方法，F(xiàn)PA可用于布氏桿菌病抗體檢測和畜群布氏桿菌病篩查和凈化。

[1]世界動物衛(wèi)生組織（OIE）.陸生動物診斷試驗和疫苗手冊[M].//農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局，中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，譯.5版.北京：農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局，2004：363-364.

[2]于大海，崔硯林.中國進出境動物檢疫規(guī)范[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1997.