TNF-α刺激人牙周膜細(xì)胞表達(dá)MMP-9的研究

趙戩，潘春玲，劉俊超，李倩，潘亞萍

（中國醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院牙周科，遼寧省口腔醫(yī)學(xué)研究所牙周病學(xué)研究室，沈陽 110002）

牙周致病菌侵襲牙齦上皮細(xì)胞能夠誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子如 TNF-α、IL-8 等的過度表達(dá)［1］，使組織細(xì)胞釋放較多的基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs），造成牙周組織中膠原纖維的降解［2］。當(dāng)細(xì)菌侵入組織深處時(shí)，牙周膜細(xì)胞對(duì)牙周致病菌的反應(yīng)將成為牙周組織繼續(xù)破壞的關(guān)鍵。本研究目的在于通過檢測(cè)不同濃度的TNF-α刺激人牙周膜細(xì)胞（humanperiodontal ligment cells，hPDLCs）表達(dá)MMP-9的水平，探討細(xì)菌、細(xì)胞因子和MMPs之間可能存在的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在慢性牙周炎中的重要作用。

1 材料與方法

1.1 hPDLCs的培養(yǎng)

刮取正畸原因拔除的健康無齲前磨牙的牙周膜組織，原代培養(yǎng)hPDLCs，取第4代細(xì)胞鑒定細(xì)胞來源，結(jié)果顯示抗波形絲蛋白染色陽性，抗角蛋白染色陰性，證實(shí)來源于外胚間充質(zhì)的hPDLCs。取第5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)［3，4］。

1.2 TNF-α刺激hPDLCs

實(shí)驗(yàn)組 1分別以不同濃度（1、2、5 ng/mL）的人重組TNF-α（博士德生物工程有限公司，武漢）與hPDLCs均勻混合24 h；實(shí)驗(yàn)組2以2 ng/mL的TNF-α 分別處理 hPDLCs 6 h、12 h、24 h、48 h；未經(jīng)刺激的hPDLCs作為對(duì)照組。收集細(xì)胞上清液，用于MMP-9濃度的檢測(cè)。

1.3 ELISA檢測(cè)MMP-9濃度

采用人MMP-9 ELISA試劑盒（博士德生物工程有限公司，武漢）檢測(cè)TNF-α刺激后的hPDLCs培養(yǎng)上清液相應(yīng)蛋白含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的TNF-α刺激hPDLCs表達(dá)MMP-9的水平

0、1、2、5 ng/mL TNF-α 刺激 hPDLCs 24 h 表達(dá)MMP-9的水平分別為（0.628±0.314）ng/mL、（1.995±0.789）ng/mL、（4.129±1.525）ng/mL、（7.982±2.879）ng/mL。與對(duì)照組相比，各刺激組細(xì)胞表達(dá)MMP-9水平均顯著增高（P<0.01），且各刺激組組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（圖 1）。

2.2 2 ng/mL的 TNF-α刺激 hPDLCs不同時(shí)間MMP-9的表達(dá)水平

以2 ng/mL濃度的TNF-α分別刺激hPDLCs 6 h、12 h、24 h 及 48 h，hPDLCs表達(dá) MMP-9 的水平分別為（1.074±0.427）ng/mL、（1.635±0.763）ng/mL、（4.129±1.525）ng/mL、（6.747±2.257）ng/mL。對(duì)照組（刺激0 h）的hPDLCs沒有檢測(cè)到MMP-9表達(dá)，6 h～12 h時(shí)MMP-9出現(xiàn)表達(dá)增強(qiáng)，之后持續(xù)增強(qiáng)。與6 h組對(duì)比，24 h、48 h組細(xì)胞上清中的MMP-9表達(dá)明顯增高，而且24 h與48 h組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。6 h組與12 h組間差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）（圖 2）。

3 討論

在牙周致病菌突破牙齦上皮第一道防線后，細(xì)菌及細(xì)胞因子與hPDLCs反應(yīng)所產(chǎn)生的局部環(huán)境決定著慢性牙周炎的轉(zhuǎn)歸。已有研究證實(shí)牙周致病菌侵襲牙周組織后產(chǎn)生的TNF-α能夠刺激多種細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、牙齦上皮細(xì)胞等產(chǎn)生MMPs，但能否刺激人牙周膜細(xì)胞產(chǎn)生MMPs尚不十分清楚，國內(nèi)尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著TNF-α濃度增高、作用時(shí)間延長，hPDLCs產(chǎn)生MMP-9的水平隨之增高。表達(dá)顯著增高見于以2 ng/mL TNF-α刺激24 h以后。以5 ng/mL TNF-α刺激hPDLCs產(chǎn)生MMP-9的濃度是以0 ng/mL TNF-α刺激產(chǎn)生MMP-9的12.71倍；以2 ng/mLTNF-α刺激hPDLCs 48 h后產(chǎn)生的MMP-9濃度是刺激6 h的6.28倍。說明TNF-α以時(shí)間和劑量依賴的方式刺激hPDLCs表達(dá)MMP-9。

MMPs在慢性牙周炎致病過程中的牙周結(jié)締組織破壞和骨吸收中發(fā)揮重要作用。牙周致病菌能夠激活牙齦上皮細(xì)胞、hPDLCs產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和MMPs［4］，它們參與并促進(jìn)了牙周炎的發(fā)病過程。牙周致病菌在細(xì)菌-細(xì)胞相互作用中產(chǎn)生的細(xì)胞因子，與MMPs之間同時(shí)存在著復(fù)雜的相互作用［5，6］。

牙周致病菌在與牙齦上皮細(xì)胞、hPDLCs相互作用時(shí)，牙周組織局部產(chǎn)生較多的TNF-α。TNF-α是機(jī)體炎癥反應(yīng)與免疫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)因子，能夠誘導(dǎo)多種組織細(xì)胞表達(dá)MMP-9［7］。有證據(jù)顯示TNF-α對(duì)MMPs的誘導(dǎo)作用主要是通過MAPK信號(hào)系統(tǒng)介導(dǎo)的NF-κB通路激活的［8］。牙周致病菌通過與特異性宿主受體結(jié)合，黏附并侵入牙齦上皮細(xì)胞及hPDLCs，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，激活細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)。目前已經(jīng)證實(shí)MMP-9的基因啟動(dòng)子位置存在于NF-κB、AP-1、SP-1 等多種核轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，促炎細(xì)胞因子可以通過這些位點(diǎn)上調(diào)MMP-9的表達(dá)［9，10］。其中，TNF-α 可能通過提高部分轉(zhuǎn)錄因子的活性誘導(dǎo)MMP-9表達(dá)。

本研究在國內(nèi)首次證實(shí)了TNF-α以時(shí)間和劑量依賴性的方式刺激hPDLCs表達(dá)MMP-9，提示在牙周炎癥過程中，在促炎細(xì)胞因子TNF-α的刺激下，牙周組織的主要成分hPDLCs成為MMP-9的又一個(gè)重要來源。TNF-α誘導(dǎo)炎性細(xì)胞的浸潤和活化，MMP-9則為細(xì)胞遷移創(chuàng)造了條件。由此提示，細(xì)菌、細(xì)胞因子和MMPs三者發(fā)揮協(xié)同作用，形成了牙周致病菌、細(xì)胞因子、MMPs、細(xì)胞間基質(zhì)及炎癥反應(yīng)之間復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，這與牙周炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，為牙周病病因的研究提供理論依據(jù)。

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