正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選腸瀉停膠囊的提取工藝＊

竇 芳 陳曉莉 文愛東 第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院藥劑科（西安 710032）

腸瀉停膠囊系由黃柏、地榆、石榴皮、地錦草4味藥材組成，具有清熱燥濕，涼血解毒的功能，用于濕熱蘊(yùn)結(jié)導(dǎo)致的急、慢性腸炎，泄瀉、痢疾等腸道疾病。黃柏為腸瀉停膠囊的主要組成部分，性味苦寒，有清熱燥濕，瀉火除蒸，解毒療瘡之功效。黃柏傳統(tǒng)內(nèi)服主治濕熱帶下，熱淋腳氣，瀉痢黃疸，陰虛發(fā)熱，盜汗遺精等，同時(shí)黃柏治療癰瘍腫毒功效顯著，此外還常用于治療皮膚濕疹，水火燙傷［1］?！侗静菥V目》記載：“地榆，除下焦熱，治大小便血證。止血，取上截切片炒用，其梢則能行血，不可不知。楊士瀛云：諸瘡?fù)凑呒拥赜埽W者加黃芩”。《本草綱目》記載：石榴皮“止瀉痢，下血，脫肛，崩中帶下”?！墩憬耖g草藥》記載：地錦草“健胃止瀉，治小兒疳積”。黃柏中主要含有鹽酸小檗堿，地榆、石榴皮、地錦草中均含有鞣質(zhì)，故提取工藝中選擇鹽酸小檗堿、鞣質(zhì)為檢查指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)法考察提取工藝，以確定最佳提取方案。

1 儀器與試藥 1.1 儀器Agilent 1200液相色譜儀（含真空脫氣機(jī)，二元泵，自動進(jìn)樣器，柱溫箱）；色譜柱：Agilent TC－C18柱（150mm×4.6mm，5μm）。

1.2 試藥 鹽酸小檗堿對照品（購自中國藥品生物制品檢定所，批號：110713－200910）。

2 方法與結(jié)果 通過參考各藥材藥理作用中所提及的提取方法，對醇提、水煎煮提取工藝進(jìn)行研究。

2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 處方中黃柏為主藥，而小檗堿等生物堿為其抗菌止瀉的主要有效成分。有文獻(xiàn)報(bào)道［2，3］，為避免小檗堿損失，黃柏不宜水煎，也不宜同其它藥材混煎。故選用乙醇對黃柏進(jìn)行提取。用高效液相色譜法測定正交實(shí)驗(yàn)提取物中鹽酸小檗堿的含量［4，5］，因此以鹽酸小檗堿的含量為評價(jià)指標(biāo)。為了確定較為合理的提取工藝，按照通行的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)［6］，擬采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)的方法，對提取工藝中的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)選，選取乙醇濃度、乙醇用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)4個(gè)主要的影響因素，各3個(gè)水平，按照L9（34）正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，選取最佳提取工藝參數(shù)。因素水平表見表1。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平表

2.2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果 稱取黃柏10g，共9份，分別按正交試驗(yàn)表所列條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，提取，濾過，量取濾液體積，取適量的濾液兩份，分別測出干膏得量與鹽酸小檗堿含量。測定結(jié)果見表2。

2.2.1 出膏量的測定：精密吸取濾液10mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105℃干燥6h，精密稱定，計(jì)算出藥材的干浸膏得量。

2.2.2 鹽酸小檗堿的含量測定：對照品溶液的制備：鹽酸小檗堿購自中國藥品生物制品檢定所，精密稱取鹽酸小檗堿適量，溶解制成每1mL含0.1mg的溶液。

樣品的測定 根據(jù)每次實(shí)驗(yàn)中小檗堿的濃度不同，將濾液稀釋至適當(dāng)濃度，分別吸取供試品溶液和對照品溶液各5μL，注入液相色譜儀，進(jìn)行測定。結(jié)果見表2。

表2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

2.3 方差分析 依據(jù)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3、表4。

表3 干浸膏量方差分析

表4 小檗堿含量方差分析

提取條件的優(yōu)選 由表2，表3和表4可看出，因素A和D對小檗堿含量有顯著影響，影響因素D＞A＞B＞C，且以D3A2B3C2為佳。故確定黃柏中小檗堿的最佳提取工藝為D3A2B3C2，即用7倍量的70%乙醇熱回流提取3次，每次1.5h。

2.4 鞣質(zhì)提取工藝的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 處方中石榴皮和地錦草主含黃酮類、鞣質(zhì)類成分，地榆中主含鞣質(zhì)、三萜皂苷類成分，以上各成分具有收斂、抗菌作用［7］，且可溶于水；另外用水煎煮簡便易行，且可降低能耗，節(jié)約成本。因此提取工藝選用水提取，為了優(yōu)化最佳提取工藝，以水煎液的出干膏量及有效成分鞣質(zhì)的含量為指標(biāo)，考察加水倍量、煎煮時(shí)間、提取次數(shù)對提取效果的影響，應(yīng)用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)的方法，見表5。

表5 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平表

2.5 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果 按處方取黃柏醇提藥渣定量，按一定比例稱取地榆、石榴皮和地錦草共22.5g，共9份，按各實(shí)驗(yàn)號對應(yīng)的提取液，加水煎煮，趁熱濾過，量取濾液體積，取適量的濾液兩份，分別測定出膏量與鞣質(zhì)含量。測定結(jié)果見表6。

2.5.1 出膏量的測定：精密吸取濾液10mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105℃干燥6h，精密稱定，計(jì)算出藥材的干膏得量。

2.5.2 鞣質(zhì)的含量測定：按照鞣質(zhì)含量測定法（中國藥典2010版一部 附錄XB）測定。

總水溶性部分的測定：精密量取供試品溶液25mL，蒸干，殘?jiān)?05℃干燥3h，稱重（T1）。

不與皮粉結(jié)合的水溶性部分的測定：精密量取供試品溶液100mL，加皮粉（干燥品6g），振搖15min，濾過，精密量取濾液25mL，蒸干，殘?jiān)?05℃干燥3h，稱重（T2）。

皮粉水溶性部分的測定：精密量取水100mL，加皮粉（干燥品6g），振搖15min，濾過，精密量取濾液25mL，蒸干，殘?jiān)?05℃干燥3h，稱重（T0）。

按下式計(jì)算鞣質(zhì)的含量：

鞣質(zhì)含量＝T1―T2＋T0

2.6 方差分析 依據(jù)表6中的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表7和表8。

提取條件的優(yōu)選：由表6，表7和表8可看出，各因素對鞣質(zhì)的含量影響不大，各因素影響C＞A＞B，且以C3A3B3為佳。從結(jié)果可看出因素B2和B3的結(jié)果差異很小，考慮成本因素，故確定該提取工藝為C3A3B2，即用15倍量的水煎3次，每次1.5h。

2.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 以醇提最優(yōu)提取工藝為D3A2B3C2和水提最優(yōu)提取工藝為C3A3B2進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，黃柏藥材鹽酸小檗堿含量為13.9mg／g，藥材中鞣質(zhì)含量為32.9mg／g。

表6 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

表7 干膏得量方差分析

表8 鞣質(zhì)含量方差分析

3 結(jié)論與討論 本研究優(yōu)化了該復(fù)方的提取工藝。通過正交實(shí)驗(yàn)，確定該復(fù)方的最佳工藝為：取黃柏飲片，加7倍量的70%乙醇回流，提取3次，每次1.5h，趁熱過濾，合并濾液，回收乙醇，備用。然后將黃柏藥渣與其余3味藥材按處方量合并，用15倍量的水煎3次，每次1.5h，合并濾液，水浴濃縮到一定濃度，與黃柏濃縮液合并，繼續(xù)濃縮至一定濃度。該方法具有工藝條件合理、可靠，為腸瀉停膠囊工業(yè)化提取提供了科學(xué)依據(jù)。腸瀉停膠囊具有清熱燥濕，涼血解毒。用于濕熱蘊(yùn)結(jié)導(dǎo)致的急、慢性腸炎，泄瀉、痢疾等腸道疾病。

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