HPLC法測定不同產(chǎn)地山里紅中表兒茶素含量

★ 邵峰 谷麗菲 劉榮華＊ 黃慧蓮 陳慧娟 江東龍 (江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室 江西南昌330004)

山楂為薔微科山楂屬植物山里紅(Crataegus pinnatifida Bge.var.major.N.E.Br.)或山楂(Crataegus pinnatifida Bge.)的干燥成熟果實，具有消食健胃、行氣散瘀，等功效，臨床常用于治療肉食積滯、胃脘脹滿、瀉痢腹痛、瘀血經(jīng)閉，等病癥［1］。作為黃烷醇類化合物，表兒茶素具有保護(hù)心肌［2］、降血脂［3，4］以及對抗膽酸引起的肝細(xì)胞凋亡［5］，等藥效作用。鑒于此，本研究采用HPLC法，對不同產(chǎn)地山里紅中的表兒茶素進(jìn)行含量測定，為建立山里紅質(zhì)量控制方法提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國，VWD檢測器，1260化學(xué)工作站)，BT25S型十萬分之一電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)，BT5S型萬分之一電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)，N－1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(東京理化器械(株)獨資工廠)，KQ－300VDB型雙頻數(shù)控超聲清洗器(江蘇省昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 表兒茶素對照品(批號:110878－200102)均購自中國藥品生物制品檢定所。乙腈(色譜純)購自美國Dikma公司，磷酸(分析純)購自西隴化工股份有限公司，雙蒸水(實驗室自制)。

山里紅采集時間為2012年11月，所有藥材經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)劉榮華教授鑒定，保存于江西中醫(yī)藥大學(xué)標(biāo)本館，見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液制備 精密稱取表兒茶素6.5mg，置于10mL容量瓶中，加入8%甲醇溶液定容至刻度，得到濃度為 0.65mg/mL的對照品母液，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，備用。

2.2 供試品溶液制備 稱取干燥的山里紅樣品100g，經(jīng)粉碎，加入70%的乙醇500mL，在70℃條件下回流提取3次，每次1h，經(jīng)過濾，合并濾液，減壓回收溶劑，得到山里紅總提取物。取一定量的的山里紅總提取物置于10mL容量瓶中，加甲醇，超聲提取30min，放置室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.22μm微孔濾膜，得到供試品溶液。

2.3 色譜條件 色譜柱YMC－Triart C18(250mm×4.6mm，5μm);流動相:乙腈(A)～0.4%磷酸溶液(B)，梯度洗脫，0 ～10min，8% ～15%A;10 ～30min，15% ～15%A。流速1mL/min，檢測波長280nm，柱溫25℃，進(jìn)樣量20μL。理論塔板數(shù)大于3000，見圖1。

圖1 山里紅HPLC色譜圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取溶液濃度分別為0.00166，0.0166，0.083，0.166，0.83，1.00mg/mL 表兒茶素對照品溶液，按“2.3”項下色譜條件測定峰面積。以進(jìn)樣濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立表兒茶素回歸方程，即 Y=11741X － 12.712，r=0.9993，在0.00166～1.00mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.4.2 精密度試驗 精密吸取表兒茶素對照品溶液20μL，按“2.3”項下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，計算峰面積的RSD為0.043%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，按“2.2”項方法制備供試品溶液及“2.3”項下色譜條件，分別在第0，2，4，6，8，10h 間隔進(jìn)樣 20μL，測得表兒茶素峰面積積分值，計算供試品 RSD為1.92%，表明樣品在10h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗 取同一產(chǎn)地山里紅樣品，按“2.2”項方法制備供試品溶液 6份及“2.3”項下色譜條件，進(jìn)樣20μL，測得表兒茶素的峰面積積分值，計算供試品RSD為2.51%，表明樣品制備方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收試驗 取已知表兒茶素含量的山東省臨沂市沂水縣產(chǎn)山里紅藥材6份，每份1.0g，精密稱定，按“2.2”項方法制備供試品溶液，加入適量的表兒茶素對照品，按“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣20μL，測定表兒茶素含量并計算回收率，見表2。

2.4.6 樣品含量測定 精密吸取已制備的不同產(chǎn)地山里紅待測溶液各20μL，注入液相色譜儀，測定表兒茶素峰面積積分值，利用外標(biāo)法分別計算表兒茶素的含量，結(jié)果表明:山里紅中表兒茶素含量在0.04% ～0.21%范圍內(nèi)，其中，山東省青州市出產(chǎn)的山里紅含量最高，山西省運城市絳縣出產(chǎn)的山里紅含量最低。見表3。

表2 表兒茶素加樣回收率測定

表3 不同產(chǎn)地山里紅中表兒茶素含量測定(n=3)

3 討論

生物體內(nèi)的氧自由基在心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展方面起著重要的作用。本課題組曾研究發(fā)現(xiàn)，山楂葉中的表兒茶素對于羥自由基和過氧化氫具有較強(qiáng)的清除活性［6］。鑒于此，本研究在以往相關(guān)文獻(xiàn)報道的基礎(chǔ)上［7－9］，采用 HPLC 定量分析技術(shù)，建立山里紅中表兒茶素含量測定的方法。該方法操作簡單，準(zhǔn)確，重復(fù)性好，易于推廣。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典﹒一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:29.

［2］曹瑩，梁日欣，楊濱，等.(－)－兒茶素沒食子酸酯和(+)－表兒茶素對心肌細(xì)胞保護(hù)作用研究［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2006，12(10):36 －38.

［3］林親錄，施兆鵬，劉湘新，等.兒茶素和表兒茶素對動物血脂的影響［J］.中國食品學(xué)報，2002，2(3):16 －20.

［4］劉湘新，林親錄，施兆鵬，等.兒茶素和表兒茶素對小白鼠血清脂質(zhì)的影響［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2002，28(3):232－233.

［5］余晶，Vladim ir Khaoustov，徐玉敏，等.表兒茶素對?；撬崦撗跄懰嵴T導(dǎo)Huh7細(xì)胞凋亡的作用［J］.中國中藥雜志，2009，34(10):1 272－1 275.

［6］劉榮華，陳蘭英，朱根華，等.單籽山楂葉中多元酚類成分及其抗氧化活性研究［J］.中草藥，2007，38(10):1 541 －1 544.

［7］劉建利，原江鋒，閻娥，等.山楂多分含量的反相高效液相色譜法測定［J］.食品科學(xué)，2009，30(14):163 －166.

［8］陳承瑜，楊濱，周潔.山楂飲片的質(zhì)量評價研究［J］.中國實驗方劑學(xué)，2009，15(12):1 －3.

［9］章弘揚，張弛，王月榮，等.山楂中黃酮類成分的定性和定量分析［J］.中國中藥雜志，2012，37(5):601 －604.