三黃散瘀巴布劑中大黃與黃芩的提取工藝研究

尹 華， 章建華， 許叢輝， 劉云飛， 王 玲

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310053;2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江杭州 310006)

三黃散瘀巴布劑由大黃、黃芩和黃柏等藥味組成，具有活血祛瘀、行氣止痛、消腫散結(jié)的作用，可用于治療軟組織損傷?，F(xiàn)代研究表明，大黃具有抗腫脹、抗菌消炎和免疫作用，其活性成分為蘆薈大黃素、大黃酸等蒽醌類成分［1-2］;黃芩具有消炎作用，其主要活性成分為黃芩苷［3］等黃酮類成分。透皮吸收試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大黃中游離蒽醌與結(jié)合蒽醌、黃芩中的黃芩苷均可以透過(guò)皮膚角質(zhì)層，產(chǎn)生藥效，因此，本實(shí)驗(yàn)選用上述成分的轉(zhuǎn)移率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行制備工藝的考察，對(duì)方中各藥味均建立了評(píng)價(jià)指標(biāo)，可全面客觀反映制備工藝各因素的影響。

根據(jù)課題組前期實(shí)驗(yàn)研究，已知大黃與黃芩合提，黃柏單獨(dú)提取更有利于藥效成分的提出 (相關(guān)數(shù)據(jù)整理成文待發(fā)表)，故本試驗(yàn)采取大黃、黃芩合提，黃柏單提的方法。以蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚和黃芩苷等多個(gè)指標(biāo)的轉(zhuǎn)移率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)合綜合加權(quán)評(píng)分法篩選優(yōu)化提取工藝。

1 材料、儀器及試劑

1.1儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀 (美國(guó)安捷倫);Sartorius BD211D十萬(wàn)分之一電子天平 (德國(guó)塞多利斯);Sartorius BS110S萬(wàn)分之一電子天平 (德國(guó)塞多利斯);CLAUVFM純水機(jī) (英國(guó) ELGA);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海申生);KQ5200B型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2材料與試劑 蘆薈大黃素對(duì)照品、大黃酸對(duì)照品、大黃素對(duì)照品、大黃酚對(duì)照品、大黃素甲醚對(duì)照品、黃芩苷對(duì)照品 (中國(guó)藥品生物制品檢定所，供定量測(cè)定用，批號(hào)分別為:110795-200605、0757-200206、0756-200211、110796-200310、110758-2-509、110715-200514);大黃 (20091030，20070822，20070727，甘肅 掌葉大黃)、黃芩 (20091030，20071003，20070119，內(nèi)蒙古)分別購(gòu)自華東醫(yī)藥有限公司和浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院張如松教授鑒定為正品，符合2005年版《中國(guó)藥典》(一部)規(guī)定;甲醇 (色譜純，美國(guó)TEDIA公司);水為過(guò)0.2 μm濾膜的純水;其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

結(jié)合處方中各藥味的理化性質(zhì)［1-4］:黃柏中的主要有效成分鹽酸小檗堿為季銨鹽，大黃中蒽醌類成分和黃芩中有效成分黃芩苷都呈酸性，可以與鹽酸小檗堿形成鹽，沉淀析出，所以若將三者合提會(huì)降低有效成分轉(zhuǎn)移率，因此黃柏適合單獨(dú)提取，大黃中的蒽醌類成分與黃芩中黃芩苷結(jié)構(gòu)相似適合合提，本試驗(yàn)前期對(duì)各藥味的配伍提取方式進(jìn)行考察，大黃、黃芩、黃柏單提、兩兩合提、三藥合提;結(jié)果表明大黃和黃芩合提，黃柏單獨(dú)提取時(shí)，各指標(biāo)成分的轉(zhuǎn)移率均較高，提取率亦均高于其它配伍提取方式 (相關(guān)數(shù)據(jù)整理成文待發(fā)表)。故而確定大黃和黃芩合提，黃柏單提。以君藥大黃中蒽醌類成分和臣藥黃芩中黃芩苷的轉(zhuǎn)移率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用多指標(biāo)綜合加權(quán)評(píng)分法 (蘆薈大黃素∶大黃酸 ∶大黃素 ∶大黃酚 ∶大黃素甲醚 ∶黃芩苷的權(quán)重系數(shù)為0.12∶0.12∶0.12∶0.12∶0.12∶0.4)，對(duì)各工藝參數(shù)進(jìn)行考察，優(yōu)化提取工藝，并對(duì)最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

2.1 蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的測(cè)定［5-6］

2.1.1 色譜條件 Agilent 1200高效液相色譜儀 (DAD);Zorbax Eclipse SB-C18色譜柱 (4.6 mm ×150 mm，5 μm);流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫 (見(jiàn)表1);檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm;體積流量1.0 mg/mL;柱溫25℃;進(jìn)樣量10 μL，理論塔板數(shù)以大黃素峰計(jì)不低于3 000。

表1 梯度洗脫程序

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇配成質(zhì)量濃度分別為0.214 5、0.156 8、0.187 7、0.374 0、0.110 5 mg/mL的混合對(duì)照品貯備液。精密吸取上述混合對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。按2.1.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)定。以質(zhì)量濃度X(mg/mL)分別對(duì)峰面積Y進(jìn)行線性回歸，得蘆薈大黃素回歸方程為:Y=34.95X+0.769 6(r=0.999 4)，線性范圍為2.145～21.45 mg/mL;大黃酸回歸方程為:Y=36.88X-8.289(r=0.999 8)，線性范圍為1.568～15.68 mg/mL;大黃素回歸方程為:Y=32.49X-0.412 0(r=0.999 4)，線性范圍為1.877～18.77 mg/mL;大黃酚回歸方程為:Y=39.31X-8.20(r=0.999 7)，線性范圍為3.740～37.40 mg/mL;大黃素甲醚回歸方程為:Y=17.37X-3.438(r=0.999 5)，線性范圍為1.105～8.842 mg/mL。

2.1.3 加樣回收試驗(yàn) 精密吸取已知含有量的提取液0.5 mL，分別精密加入蘆薈大黃素對(duì)照品溶液 (0.107 2 mg/mL)0.10 mL，大黃酸對(duì)照品溶液 (0.078 4 mg/mL)0.11 mL，大黃素對(duì)照品溶液 (0.093 8 mg/mL)0.08 mL，大黃酚對(duì)照品溶液 (0.187 0 mg/mL)0.11 mL，大黃素甲醚對(duì)照品溶液 (0.055 2 mg/mL)0.12 mL，按2.1.4項(xiàng)樣品測(cè)定項(xiàng)下供試液的制備方法平行制備6份，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果表明蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均回收率分別為100.3%(RSD為2.2%，n=6)、101.3%(RSD為2.5%，n=6)、100.5%(RSD為2.2%，n=6)、100.8%(RSD為1.5%，n=6)、98.48%(RSD為2.9%，n=6)，均符合要求。

2.1.4 樣品測(cè)定 精密吸取各工藝提取液1.0 mL，每批平行取2份，加8%鹽酸溶液10 mL，三氯甲烷10 mL，水浴加熱回流1.0 h，放冷，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，靜置、分層，取三氯甲烷層，水層再用三氯甲烷萃取2次，每次10 mL，合并三氯甲烷層，回收三氯甲烷，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜?0 mL，搖勻，過(guò)膜即得，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL測(cè)定。與同批藥材比較，計(jì)算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含有量及轉(zhuǎn)移率。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品 (A)和提取液 (B)HPLC色譜圖

2.2 黃芩苷測(cè)定［4，7］

2.2.1 色譜條件 Agilent 1200高效液相色譜儀 (DAD);Zorbax Eclipse SB-C18色譜柱 (4.6 mm ×150 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇-0.2%磷酸，梯度洗脫見(jiàn)表2;檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm;體積流量1.0 mL/min;柱溫25℃;進(jìn)樣量10 μL，理論塔板數(shù)以黃芩苷峰計(jì)不低于2 500。

表2 梯度洗脫程序

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇配成1.130 mg/mL的黃芩苷對(duì)照品貯備液;精密吸取此貯備液1.0 mL，加甲醇定容至10 mL，搖勻，配成0.113 0 mg/mL的黃芩苷對(duì)照品溶液;精密吸取對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、8.0 mL置10 mL棕色量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。按2.2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣10 μL，測(cè)定。以黃芩苷的質(zhì)量濃度X(mg/mL)對(duì)峰面積Y進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為:Y=31.00X-32.65(r=0.999 8)，表明黃芩苷在5.60～90.40 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3 加樣回收試驗(yàn) 精密吸取已知含有量的提取液0.5 mL，精密加入黃芩苷對(duì)照品溶液 (1.130 mg/mL)0.8 mL，按2.2.4項(xiàng)下供試品溶液的制備方法平行制備6份，按2.2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣10 μL，測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果表明黃芩苷的平均回收率為102.1%(RSD為1.7%，n=6)，符合要求。

2.2.4 樣品測(cè)定 精密吸取各藥液1.0 mL，每批平行2份，用流動(dòng)相溶解并定容至10 mL，再精密吸取1.0 mL加流動(dòng)相定容至10 mL，搖勻，過(guò)膜即得，進(jìn)樣10 μL測(cè)定，與同批飲片比較，計(jì)算提取液中黃芩苷的含有量及轉(zhuǎn)移率。色譜圖見(jiàn)圖2。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 提取方法的考察 取大黃、黃芩飲片3份，每份各為25 g，加8倍量60%乙醇，分別采用冷浸 (浸泡24 h)、超聲 (2次，每次60 min)、回流 (2次，每次1.5 h)法進(jìn)行提取，將各醇提液回收乙醇并濃縮至0.05 g(總生藥量)/mL，測(cè)定各提取液中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚和黃芩苷的含有量，計(jì)算其轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見(jiàn)表3，回流提取效率明顯優(yōu)于冷浸法和超聲法，故選擇回流提取法。

圖2 對(duì)照品 (A)和提取液 (B)HPLC色譜圖

表3 提取方法考察結(jié)果(n=2)

2.3.2 提取溶劑的考察 根據(jù)處方中各藥味所含有效成分的理化性質(zhì)，考察水和60%乙醇兩種提取溶劑。取大黃、黃芩飲片3份，每份各為25 g，加8倍量水或60%乙醇溶液，回流提取2次，每次1.5 h，提取液減壓濃縮至0.05 g(總生藥量)/mL，測(cè)定提取液中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、黃芩苷的含有量，并計(jì)算轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見(jiàn)表4。由表可知，60%乙醇溶液回流的提取效率優(yōu)于水提取，故確定以60%乙醇作為提取溶劑。

表4 提取溶劑考察結(jié)果(n=2)

2.3.3 溶劑用量的考察 取大黃、黃芩飲片3份，每份各為25 g，分別加8、10、12倍量60%乙醇溶液，回流提取1.0 h，提取2次，提取液減壓濃縮至0.05 g(總生藥量)/mL，測(cè)定提取液中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、黃芩苷的含有量并計(jì)算轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果表明，隨溶劑用量增加，提取效率增高，但10倍與12倍量溶劑并無(wú)顯著差異，從成本及能耗角度考慮，確定用10倍量溶劑。

表5 溶劑用量考察結(jié)果 (n=2)

2.4 正交試驗(yàn) 稱取大黃、黃芩飲片9份，每份各25 g，以10倍量60%乙醇溶液回流提取，采用L9(34)正交試驗(yàn)法［1-2］，考察回流時(shí)間、含乙醇量和提取次數(shù)等因素對(duì)蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚和黃芩苷轉(zhuǎn)移率的影響，提取液中5種蒽醌類成分和黃芩苷的轉(zhuǎn)移率的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6，以多指標(biāo)綜合加權(quán)評(píng)分法 (蘆薈大黃素∶大黃酸∶大黃素 ∶大黃酚 ∶大黃素甲醚 ∶黃芩苷的權(quán)重系數(shù)為0.12∶0.12∶0.12∶0.12∶0.12∶0.4)評(píng)價(jià)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的直觀分析和方差分析見(jiàn)表6、表7。

直觀分析顯示:各因素作用主次為A(提取次數(shù))＞B(回流時(shí)間)＞C(含乙醇量);方差分析顯示:因素A(提取次數(shù))、B(回流時(shí)間)的影響有顯著性差異，因素C(含乙醇量)的影響無(wú)顯著性差異，則兩者的較佳提取工藝為:A3B3C2，即加10倍量60%乙醇溶液，回流提取3次，每次1.5 h。選擇A3B3C2作為方案進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

表6 大黃與黃芩合提工藝L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

表7 方差分析

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取大黃、黃芩飲片3份，每份各25 g，按優(yōu)化的提取工藝 (10倍量60%乙醇溶液，回流提取3次，每次1.5 h)提取，測(cè)定提取液中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、黃芩苷的含有量及轉(zhuǎn)移率，驗(yàn)證最佳提取工藝的合理性，3份提取工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8，各成分提取均較完全，且重復(fù)性較好，表明正交試驗(yàn)得到的提取工藝切實(shí)可行。

表8 大黃與黃芩合提工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 提取工藝的考察［1-3］根據(jù)處方中各藥味中有效成分的理化性質(zhì)，黃柏中主要有效成分鹽酸小檗堿為季銨鹽，大黃中蒽醌類成分和黃芩中黃芩苷均呈酸性，三者合提易形成鹽，沉淀析出，會(huì)降低有效成分的轉(zhuǎn)移率。因此進(jìn)行了各藥味配伍提取方式考察 (大黃、黃芩、黃柏單提、兩兩合提、三藥合提)，以各成分轉(zhuǎn)移率和提取率為指標(biāo)，結(jié)果表明大黃、黃芩合提，黃柏單提較優(yōu)，故最終確定以大黃、黃芩合提，黃柏單提為提取工藝。

3.2 評(píng)價(jià)指標(biāo)的選擇及權(quán)重系數(shù)的確定 中藥各成分多且復(fù)雜，而復(fù)方由多味中藥組成，其成分也就更為復(fù)雜，因此在進(jìn)行制備工藝考察時(shí)，評(píng)價(jià)指標(biāo)的確定尤為關(guān)鍵。本試驗(yàn)采用了多味藥有效成分 (指標(biāo)成分)的轉(zhuǎn)移率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)合綜合加權(quán)評(píng)分法，進(jìn)行工藝優(yōu)化?？紤]到大黃為君藥，起主要作用，黃芩為臣藥，且結(jié)合組方的量，大黃與黃芩合提工藝的正交試驗(yàn)采用多指標(biāo)綜合加權(quán)評(píng)分法評(píng)價(jià)，確定蘆薈大黃素 ∶大黃酸 ∶大黃素 ∶大黃酚 ∶大黃素甲醚;黃芩苷轉(zhuǎn)移率的權(quán)重系數(shù)為0.12∶0.12∶0.12∶0.12∶0.12∶0.4，既反映大黃君藥的作用，又體現(xiàn)君、臣藥的作用強(qiáng)度，與中醫(yī)藥理論相符合。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用單因素和正交試驗(yàn)法，測(cè)定方中君、臣藥的有效成分蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、黃芩苷的轉(zhuǎn)移率，借助多指標(biāo)綜合加權(quán)評(píng)分法，優(yōu)化三黃散瘀巴布劑中大黃與黃芩合提的提取工藝。所優(yōu)選的工藝合理可行穩(wěn)定，且重現(xiàn)性好，有效成分能較好地被提取出來(lái);另一方面，本實(shí)驗(yàn)對(duì)方中的兩味藥建立了綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，較傳統(tǒng)的以單一化學(xué)成分的轉(zhuǎn)移率或浸膏得率來(lái)衡量制備工藝更為全面合理。

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