大孔樹脂-梯度高速逆流色譜分離巫山淫羊藿中雙藿苷A和朝藿定C

謝娟平， 孫文基

(1.安康學(xué)院化學(xué)化工系，陜西 安康 725000;2.西北大學(xué)陜西省生物醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710069)

巫山淫羊藿Epimedium wushanenseT.S.Ying為小檗科淫羊藿屬植物，具有抗病原微生物、抗骨質(zhì)疏松及改善心腦血管系統(tǒng)循環(huán)的作用，是淫羊藿屬藥材的主流品種之一。由于巫山淫羊藿所含成分以朝藿定C為主，2010年版中國(guó)藥典將其單列，并規(guī)定其質(zhì)量控制指標(biāo)為朝藿定C，此外，巫山淫羊藿中常與朝藿定C共存另一主要成分雙藿苷A。隨著藥典將其單列，巫山淫羊藿高純度有效成分的制備研究逐漸活躍，而文獻(xiàn)報(bào)道朝藿定C和雙藿苷A的純化分離較為少見［1-5］，因此，開展巫山淫羊藿主要成分朝藿定C和雙藿苷A的分離純化研究，建立相關(guān)成分的高效分離純化方法，為檢測(cè)提供標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，為新藥開發(fā)提供原料藥具有重要意義。

大孔樹脂具有良好的大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和較大的比表面積，這種高分子吸附材料可以通過物理吸附從水溶液中有選擇地吸附有機(jī)物，被廣泛的應(yīng)用于中草藥有效成分的粗體分離。高速逆流色譜 (HSCCC)是一種液液分配色譜，固定相通過重力場(chǎng)和離心力場(chǎng)作用被保留在分離柱內(nèi)，克服了固相載體對(duì)吸附造成的樣品損失、變性等缺點(diǎn)，可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)高效制備性分離，因而在中藥有效成分分離與純化方面得到了廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用D101大孔樹脂對(duì)巫山淫羊藿有效成分進(jìn)行粗分離，結(jié)合梯度HSCCC法純化，以二氯乙烷-甲醇-水 (4∶4.5∶2，V/V)體系的上相做固定相，下相做流動(dòng)相，轉(zhuǎn)速為850 r/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm條件下進(jìn)行分離制備，460 min內(nèi)從巫山淫羊藿中分離得到兩個(gè)高純度的黃酮類化合物，所得產(chǎn)物經(jīng)TLC及HPLC分析為雙藿苷A和朝藿定C，經(jīng)HPLC歸一化法分析，其純度分別為95.2%和93.8%。本實(shí)驗(yàn)所用方法簡(jiǎn)單，單次制備樣品量大，分離效率高，可作為從巫山淫羊藿中同時(shí)制備分離高純度雙藿苷A和朝藿定C的方法。

1 儀器、試劑與材料

TBE2300A高速逆流色譜儀 (深圳同田生化技術(shù)有限公司);分離體積300 mL，20 mL進(jìn)樣圈;柱塞式泵 (北京圣益通技術(shù)開發(fā)有限公司);HX21050恒溫循環(huán)器 (北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);N2000色譜工作站 (浙江大學(xué)智能信息工程研究所);D2101型大孔樹脂 (西安藍(lán)深公司);R—201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海申勝生物技術(shù)有限公司);WATERS高效液相色譜儀 (美國(guó)，WATERS公司)，包括2695泵，2487紫外檢測(cè)器，Empower色譜工作站。

巫山淫羊藿粗提物的制備用溶劑為工業(yè)酒精，HSCCC分離用溶劑 (二氯乙烷、甲醇等)及其它試劑均為分析純 (天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)。雙藿苷A和朝藿定C對(duì)照品均為自行分離精制，并經(jīng) UV、IR、FAB、MS、HNMR、CNMR鑒定結(jié)構(gòu)，HPLC檢測(cè)，面積歸一化法計(jì)算純度，均大于98%;HPLC分析用乙腈為色譜純，實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水并經(jīng)0.45 μm水系濾膜過濾;兩年生巫山淫羊藿全草采自安康市平利縣鳳凰山，經(jīng)陜西省安康市藥品檢驗(yàn)所胥道寶主任藥師鑒定為巫山淫羊藿Epimedium wushanenseT.S.Ying。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品制備 巫山淫羊藿全草500 g，切段，加10倍水煎煮2次，每次1 h，過濾，合并濾液并濃縮。濃縮液上600 g D101大孔樹脂層析提純，靜置2～3 h，待樹脂充分吸附后，用水洗脫至洗脫液無色，棄去，再用50%乙醇洗脫，體積流量2～3 mL/min，收集洗脫液，回收乙醇，干燥。洗脫液用薄層色譜法檢驗(yàn)顯示以雙藿苷A和朝藿定C為主。

2.2 溶劑體系的選擇 以薄層分析所用的展開系統(tǒng)二氯甲烷-甲醇-水為基礎(chǔ)，參照文獻(xiàn) ［6-13］，調(diào)整二氯甲烷-甲醇-水 (4∶X∶2，V/V)體系中甲醇的比例，測(cè)定分配系數(shù)，選擇符合實(shí)際需要的溶劑系統(tǒng)。按比例配制溶劑體系，充分振搖，靜置過夜。分別取1 mL上相溶液和下相溶液，置于裝有約2 mg待分離樣品的離心管中，輕微振蕩使其完全溶解。約1.5 h后，分離上、下相。用HPLC法測(cè)定待測(cè)樣品在上相溶液和下相溶液中的濃度，雙藿苷A和朝藿定C在各溶劑上相和下相的濃度之比即為分配系數(shù)K。

2.3 TLC及HPLC色譜分析 采用TLC及HPLC法分析巫山淫羊藿成分和經(jīng)過HSCCC分離純化后的雙藿苷A和朝藿定C純度。TLC分析展開劑為二氯甲烷-甲醇-水 (3∶1∶0.1)，雙藿苷A和朝藿定C對(duì)照品為自制品。HPLC分析條件為WATERS SUNFIRETM C18柱色譜柱 (5 μm，4.6 mm ×250 mm);檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm;流動(dòng)相為乙腈-水 (25∶75，V/V)，體積流量1.0 mL/min。

2.4 高速逆流色譜分離條件 于分液漏斗中配制二氯乙烷-甲醇-水 (4∶4.5∶2，V/V)，充分振搖后靜置過夜，分相。超聲脫氣15 min，以上相為固定相，下相為流動(dòng)相。調(diào)整高速逆流色譜條件，樣品出峰檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，主機(jī)轉(zhuǎn)速為850 r/min，流動(dòng)相體積流量為1.0～2.5 mL/min。

2.5 HSCCC分離進(jìn)樣量 進(jìn)樣量從30 mg起，以30 mg為梯度，按條件進(jìn)行HSCCC分離，到270 mg時(shí)樣品不能達(dá)到基線分離，即為最大進(jìn)樣量。

3 結(jié)果

3.1 TLC色譜分析結(jié)果 見圖1。

圖1 巫山淫羊藿粗提物TLC圖譜Fig.1 TLC of the crude extract of Epimedium wushanense T.S.Ying

大孔樹脂50%乙醇洗脫物和經(jīng)過HSCCC分離純化后的兩個(gè)主要產(chǎn)物，用甲醇溶解，以雙藿苷A和朝藿定C(自制)為對(duì)照，于硅膠薄層板點(diǎn)樣，二氯甲烷-甲醇-水 (3∶1∶0.1)展開，1%三氯化鋁乙醇溶液顯色，結(jié)果粗提物中主要的斑點(diǎn)及分離純化產(chǎn)物分別在與對(duì)照品相同位置顯黃色斑點(diǎn)。表明粗提物中以雙藿苷A和朝藿定C為主，HSCCC分離所得兩個(gè)產(chǎn)物分別為雙藿苷A和朝藿定C。

3.2 粗提物的高效液相色譜圖 大孔樹脂50%乙醇洗脫物的色譜圖 (圖2)表明，粗提物中至少含有6種化合物，但以雙藿苷A和朝藿定C為主，面積歸一化法測(cè)定，雙藿苷A和朝藿定C純度分別為45.3%和38.6%。

圖2 巫山淫羊藿粗提物HPLC分析圖譜Fig.2 Chromatogram of the crude extract of Epimedium wushanense T.S.Ying

3.3 溶劑體系選擇 文獻(xiàn)報(bào)道使用HSCCC分離黃酮苷的體系主要為三氯甲烷-甲醇-水，石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水等。但對(duì)于使用HSCCC同時(shí)分離巫山淫羊藿中雙藿苷A和朝藿定C的方法尚無報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)選擇二氯甲烷-甲醇-水為溶劑，通過調(diào)節(jié)溶劑體系在不同體積的配比，測(cè)定了7種溶劑體系，考察了巫山淫羊藿粗提物中雙藿苷A和朝藿定C的分配系數(shù)，篩選出了對(duì)巫山淫羊藿粗提物分離效果較好、固定相保留率較高的體系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 雙藿苷A和朝藿定C在7種溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)(K)Tab.1 Distribution coefficient of diphylloside A and epimedin C in seven solvent systems

選擇合適的溶劑系統(tǒng)是高速逆流色譜法分析的關(guān)鍵。HSCCC進(jìn)行樣品分離中理想的溶劑系統(tǒng)分配系數(shù)應(yīng)在0.5～2.0之間［14-15］。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC測(cè)定樣品在兩相中的分配系數(shù)，最終選擇二氯乙烷-甲醇-水 (4∶4.5∶2，V/V)作為溶劑系統(tǒng)。

3.4 梯度HSCCC體積流量及最大進(jìn)樣量 采用等度體積流量HSCCC分離雙藿苷A和朝藿定C時(shí)發(fā)現(xiàn)第一個(gè)待分離雙藿苷A色譜峰出峰時(shí)間較長(zhǎng)，而與第二個(gè)色譜峰朝藿定C之間間隔時(shí)間太短，不利于物質(zhì)的收集及高度純化，因此，經(jīng)試驗(yàn)采用梯度 HSCCC分離樣品，2.55 mL/min(0～90 min)，1.00 mL/min(90～200 min)，至 250 min時(shí)，朝藿定C峰完全流出，且相互間分離良好。

進(jìn)樣量30 mg～270 mg，HSCCC分離均良好;進(jìn)樣量達(dá)到300 mg時(shí)主峰和雜質(zhì)峰不能基線分離。故確定最大進(jìn)樣量為270 mg，色譜圖如圖3所示。

圖3 巫山淫羊藿粗提物的等度 (A)和梯度 (B)HSCCC分離色譜圖Fig.3 Chromatograms of the crude of Epimedium wushanense T.S.Ying by constant flow rate HSCCC(A)and gradient HSCCC(B)

3.5 產(chǎn)物鑒定及純度測(cè)定 采用TLC對(duì)照法與HPLC保留時(shí)間法將產(chǎn)物與對(duì)照品進(jìn)行對(duì)照，樣品在TLC上的斑點(diǎn)和對(duì)照品在同一位置，在HPLC上的保留時(shí)間與對(duì)照品保留時(shí)間一致，如圖4結(jié)果表明所分的高純度黃酮分別為雙藿苷A和朝藿定C。以高效液相色譜檢測(cè)其純度，面積歸一化法，測(cè)雙藿苷A和朝藿定C純度分別為95.2%和93.8%。

圖4 雙藿苷A(A)和朝藿定C(B)的HPLC分析圖譜Fig.4 HPLC chromatograms of diphylloside A and epimedin C

4 結(jié)論

(1)HSCCC分離中轉(zhuǎn)速越高，固定相保留值越大［14-15］，但溶劑體系容易乳化，反而降低了保留值。經(jīng)實(shí)驗(yàn)，采用850 r/min的轉(zhuǎn)速及2 mL/min的體積流量，固定相保留可達(dá)60.1%。(2)將樣品在等量上、下相溶劑中振搖溶解，測(cè)定分配系數(shù)，發(fā)現(xiàn)樣品在上相溶解度較大。因此使用上相作為溶解樣品溶劑。(3)采用等度流速HSCCC分離雙藿苷A和朝藿定C時(shí)發(fā)現(xiàn)第一個(gè)待分離雙藿苷A色譜峰出峰時(shí)間較長(zhǎng)，而與第二個(gè)色譜峰朝藿定C之間間隔時(shí)間太短，不利于物質(zhì)的收集及高度純化，因此，經(jīng)試驗(yàn)采用梯度HSCCC分離樣品。(4)隨著進(jìn)樣量的逐步加大，分離度越來越差。(5)使用大孔樹脂結(jié)合梯度高速逆流色譜同時(shí)分離純化巫山淫羊藿提取物中的雙藿苷A和朝藿定C，一次得到高純度產(chǎn)物分別50 mg和30 mg，經(jīng)HPLC測(cè)定，產(chǎn)物純度分別為95.2%和93.8%，與傳統(tǒng)硅膠柱色譜法相比，方法簡(jiǎn)便，分離周期短，分離效率高。

［1］Xie Juanping，Zhang Yongmin，Duan Kangmin，et al.Chemical constituents of roots ofEpimedium wushanenseand evaluation of their biological activities［J］.Nat Prod Res，2007，21(7):600-605.

［2］王超展，耿信篤.箭葉淫羊藿中5種黃酮類化合物的反相色譜分離制備［J］.分析化學(xué)，2005，30(1):106-108.

［3］謝娟平，向紀(jì)明，王浩東.不同方法炮制對(duì)巫山淫羊藿中主要成分朝藿定 C和淫羊藿苷的影響［J］.2011，31(4):674-677.

［4］王霄旸，謝人明，孫文基.朝藿定C平衡溶解度和表觀油水分配系數(shù)的測(cè)定［J］.藥物分析雜志，2010，30(8):1432-1434.

［5］劉敏彥，趙韶華，許紅輝，等.朝藿定C在不同血漿中蛋白結(jié)合率的研究［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，33(12):821-824.

［6］王美玲，武彥文，歐陽(yáng)杰.高速逆流色譜在天然產(chǎn)物分離純化中的應(yīng)用［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(27):14828-14830.

［7］鄭允權(quán)，李泳寧，王阿萬(wàn)，等.高速逆流色譜法分離純化紅曲色素組分［J］.食品科學(xué)，2010，31(20):192-194.

［8］于 波，彭愛一，齊 鑫，等.高速逆流色譜法分離純化青皮中六種多甲氧基黃酮［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2010，22:425-429.

［9］謝貴香，王 兵，梁逸曾，等.高速逆流色譜法對(duì)當(dāng)歸中石油醚萃取部位化學(xué)成分的分離純化［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2010，29(10):1063-1067.

［10］程會(huì)云，童 麗，杜玉枝，等.高速逆流色譜法分離制備抱莖獐牙菜中龍膽苦苷和獐牙菜苦苷［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(28):15561-15563.

［11］孫愛玲，孫清華，柳仁民.高速逆流色譜法分離純化木蝴蝶中黃芩素和白楊黃素［J］.分析化學(xué)，2006，34(特刊):243-246.

［12］喬慶亮，杜琪珍.高速逆流色譜與大孔吸附樹脂柱色譜結(jié)合分離制備生姜中的6-姜酚［J］.食品科技，2010，35(10):208-210.

［13］章能勝，王金彬，汪小艷，等.高速逆流色譜法從蝙蝠蛾擬青霉中快速分離制備麥角甾醇純品［J］.色譜，2010，28(1):68-72.

［14］王繼勇，何 瀏，袁 曉.高速逆流色譜法純化丹酚酸B工藝研究［J］.化學(xué)與生物工程，2010(9):92-94.

［15］王鳳美，陳軍輝，李 磊，等.高速逆流色譜法分離制備丹酚酸B［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2006，18:100-104.