新安軟膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

肖會(huì)敏， 何 悅， 楊 倩， 王四旺， 王劍波， 謝艷華

(第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物研究所，陜西西安710032)

新安軟膠囊主要由椒目、水飛薊素等組成。椒目采用超臨界二氧化碳萃取，經(jīng)純化得到椒目仁油［1］，水飛薊素經(jīng)過乙醇純化精制得水飛薊賓［2］。椒目仁油的主要成分是不飽和脂肪酸即油酸、亞油酸與α-亞麻酸等［3-4］;椒目仁油對(duì)大鼠、小鼠及家兔等高血脂模型均具有防治作用，認(rèn)為是通過降低血脂水平、血細(xì)胞比容、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、調(diào)節(jié)和改善脂質(zhì)代謝及血流變動(dòng)力學(xué)指標(biāo)等來實(shí)現(xiàn)，并對(duì)肝細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用［3-6］。水飛薊素的主要成分為水飛薊賓、異水飛薊賓、水飛薊寧、水飛薊亭，其中以水飛薊賓的含有量最高，其具有抗肝炎、保肝利膽、降血脂、防治動(dòng)脈粥樣硬化、抗血小板凝集等作用［7-8］。為有效控制制劑質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)對(duì)該制劑進(jìn)行了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究。

1 儀器與試藥

氣相色譜儀，Agilent 4890D型，美國(guó)安捷倫公司;高效液相色譜儀，配2695分離單元，2996二極管陣列檢測(cè)器，Empower色譜工作站，自動(dòng)進(jìn)樣器，美國(guó)Waters公司;對(duì)照品:α-亞麻酸 (批號(hào)111631-200802)，油酸 (批號(hào)111621-200608)，亞油酸 (批號(hào)111622-200602)，水飛薊賓對(duì)照品(批號(hào)752-200108，供含量測(cè)定用)，均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;新安軟膠囊，批號(hào)20091209、20091216、20091223，由第四軍醫(yī)大學(xué)藥物研究所研制;內(nèi)標(biāo):十四酸，純度98%，批號(hào)21801，上海晶純化學(xué)試劑有限公司;三氟化硼乙醚，化學(xué)純，批號(hào)20050426，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲醇，色譜純，美國(guó) Honeywell公司;冰醋酸，色譜純，天津市科米歐化學(xué)試劑開發(fā)中心;硅膠G板，青島海洋化工;其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 油酸、亞油酸和α-亞麻酸的測(cè)定［3］

2.1.1 色譜條件 以丁二酸二乙二醇聚酯(DEGS)為固定相，涂布濃度為15%不銹鋼填充柱，柱長(zhǎng)2 m，內(nèi)徑3 mm;柱溫180℃;恒溫;進(jìn)樣口溫度300℃;檢測(cè)器為氫焰離子化檢測(cè)器，溫度320℃;載氣為高純氮，體積流量40 mL/min;燃?xì)鉃闅錃猓w積流量40 mL/min;空氣，體積流量400 mL/min;進(jìn)樣量為1 μL;分離度大于1.5，理論塔板數(shù)大于1 000。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取油酸對(duì)照品46.04 mg、亞油酸對(duì)照品34.10 mg、α-亞麻酸對(duì)照品24.36 mg各置于100 mL錐底燒瓶中，加30 mL 0.5 moL/L氫氧化鉀-甲醇溶液，置于氮?dú)獗Ｗo(hù)下65℃水浴回流30 min，用流水使冷卻后，加10 mL三氟化硼乙醚液，再回流5 min，用流水使冷卻后，加入3 mL正己烷，10 mL飽和氯化鈉溶液，旋渦振搖，放置片刻，吸出上層置于5 mL量瓶中，加正己烷至刻度，作為對(duì)照品母液。

2.1.3 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 以十四酸作為內(nèi)標(biāo)，精密稱取7.35 mg，按2.1.2項(xiàng)對(duì)照品溶液制備的方法制備，得質(zhì)量濃度為1.47 mg/mL，作為內(nèi)標(biāo)溶液。

2.1.4 供試品溶液的制備 取10粒軟膠囊內(nèi)容物，剪開，傾出內(nèi)容物，混合均勻，稱取內(nèi)容物50 mg，十四酸3 mg，分別精密稱定，置于25 mL錐底燒瓶中，加5 mL 0.5 moL/L氫氧化鉀-甲醇溶液，置于氮?dú)獗Ｗo(hù)下65℃水浴回流30 min，用流水使冷卻后，加2 mL三氟化硼乙醚液，再回流5 min，用流水使冷卻后，精密加入2 mL正己烷，5 mL飽和氯化鈉溶液，旋渦振搖，放置片刻，吸出上層，作為供試品溶液。

2.1.5 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品母液0.200、0.275、0.550、0.625、1.250 mL，分別各置于2 mL量瓶中，氮?dú)獯蹈?，分別各加入0.5 mL內(nèi)標(biāo)溶液，溶解，即得，分別進(jìn)樣。以油酸、亞油酸、α-亞麻酸的峰面積對(duì)十四酸的峰面積的比值(Y1，Y2，Y3)分別對(duì)油酸、亞油酸、α-亞麻酸的質(zhì)量濃度 (X1，X2，X3)做線性回歸，得方程為Y1=0.640 5X1+0.155 1，相關(guān)系數(shù)r1為0.999 8;Y2=0.550 2X2+0.094 1，相關(guān)系數(shù)r2為0.999;Y3=0.523 4X3+0.041 4，相關(guān)系數(shù)r3為0.999，說明油酸、亞油酸、α-亞麻酸的峰面積分別在3.68～23.02 mg/mL、2.728～17.050 mg/mL、1.95～12.18 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，見圖1。

圖1 不飽和脂肪酸對(duì)照品GC圖Fig.1 GC chromatogram of unsaturated fatty acid reference standards

2.1.6 校正因子的測(cè)定 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線中油酸、亞油酸、α-亞麻酸和十四酸的峰面積計(jì)算校正因子分別為1.03(RSD值為1.73%)、1.21(RSD值為2.90%)、1.28(RSD值為2.62%)。

2.1.7 精密度實(shí)驗(yàn) 取線性考察樣品溶液(0.625 mL母液吹干，加0.5 mL內(nèi)標(biāo)液)連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積比值。油酸、亞油酸、α-亞麻酸的峰面積對(duì)十四酸峰面積比值的RSD值分別為2.73%、2.47%、2.61%，結(jié)果表明該法精密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取線性考察樣品溶液(0.625 mL母液吹干，加0.5 mL內(nèi)標(biāo)液)，按0、2、4、8、12、24 h時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣測(cè)定，油酸、亞油酸、α-亞麻酸的峰面積對(duì)十四酸的峰面積的比值的RSD值分別為1.74%、1.74%、1.53%，結(jié)果表明該法在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.9 新安軟膠囊樣品加樣回收率實(shí)驗(yàn) 采用加樣回收法，取已測(cè)知含有量的新安軟膠囊 (批號(hào)20091209，樣品中油酸、亞油酸、α-亞麻酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為19.98%、29.31%、35.88%)，分別添加油酸、亞油酸、α-亞麻酸對(duì)照品，按供試品溶液制備法操作，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果油酸、亞油酸、α-亞麻酸平均加樣回收率及其RSD值分別為 98.37%、0.65%，98.89%、0.31%，99.20%、0.60%，表明本方法具有良好的回收率。

2.1.10 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取新安軟膠囊 (批號(hào)20091209，樣品中油酸、亞油酸、α-亞麻酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為19.98%、29.31%、35.88%)，按照供試品方法制備6份樣品，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果油酸、亞油酸、α-亞麻酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值分別為3.66%、1.56%、3.16%，表明本方法穩(wěn)定。

2.1.11 3批新安軟膠囊測(cè)定 根據(jù)2.1.6項(xiàng)校正因子的測(cè)定計(jì)算。根據(jù)2.1.4項(xiàng)供試品溶液制備方法制備供試品溶液。精密吸取1 μL，注入氣相色譜儀，測(cè)定，根據(jù)校正因子按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算，結(jié)果見表1，圖2。

表1 3批新安軟膠囊樣品中不飽和脂肪酸測(cè)定結(jié)果Tab.1 Determination results of unsaturated fatty acids in three batches of Xin'an Soft Capsules samples

2.2 水飛薊賓的測(cè)定［8-9］

2.2.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱 (5 μm，4.6 mm×250 mm);流動(dòng)相為甲醇-1%冰醋酸(50∶50);檢測(cè)波長(zhǎng)288 nm;柱溫35℃;體積流量1.0 mL/min，進(jìn)樣量5 μL;分離度大于1.5，理論塔板數(shù)大于5 000。

2.2.2 供試品溶液的制備 取10粒軟膠囊內(nèi)容物，剪開，傾出內(nèi)容物，混合均勻，稱取70 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加甲醇適量并超聲使分散，靜置，澄清后用甲醇稀釋至刻度。

2.2.3 空白對(duì)照溶液的制備與測(cè)定 按處方比例及工藝自制不含水飛薊賓的空白樣品，按供試品溶液的制備方法制備，測(cè)定，結(jié)果表明處方中其它藥材不干擾水飛薊賓的測(cè)定，見圖3C。

圖2 新安軟膠囊中不飽和脂肪酸GC圖Fig.2 GC chromatogram of unsaturated fatty acid in Xin'an Soft Capsules

圖3 水飛薊賓對(duì)照品 (A)、供試品 (B)及陰性對(duì)照樣品 (C)HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of silybin reference substance(A)，Xin'an Soft Capsules sample(B)and negative sample(C)

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 精密稱取水飛薊賓對(duì)照品8.22 mg，加甲醇溶解，并定容于10 mL量瓶中。分別精密量取對(duì)照品溶液 0.10、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mL至5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取5 μL，按上述色譜條件測(cè)定峰面積。以峰面積積分值Y為縱坐標(biāo)，水飛薊賓溶液質(zhì)量濃度X(mg/mL)為橫坐標(biāo)，得線性方程為:Y=11 264 551X-122 560，相關(guān)系數(shù)r為0.999 2，表明水飛薊賓在0.016 4～0.822 0 mg/mL范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系。

2.2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一批號(hào) (20091209)新安軟膠囊10粒 (稱樣質(zhì)量0.241 39 g)，按2.2.2項(xiàng)供試品溶液的制備方法操作，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。重復(fù)進(jìn)樣6次，峰面積積分值的RSD值為0.31%，結(jié)果表明該方法精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批號(hào) (20091209)新安軟膠囊內(nèi)容物6份，按2.2.2項(xiàng)供試品溶液制備法操作，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，水飛薊賓平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.58%，RSD值為0.69%。

2.2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一批號(hào) (20091209)新安軟膠囊10粒 (稱樣質(zhì)量0.241 39 g)，按2.2.2項(xiàng)供試品溶液的制備方法操作，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。按0、0.5、1、2、4、8、12、24 h時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣，水飛薊賓峰面積值在24 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD值為0.66%。結(jié)果表明該法穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 采用加樣回收法，取已知含有量的新安軟膠囊 (批號(hào)20091209，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.58%)，分別添加水飛薊賓對(duì)照品，按2.2.2項(xiàng)供試品溶液制備法操作，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果平均加樣回收率為99.06%及其RSD值為0.57%。本法具有良好的回收率。

2.2.9 3批新安軟膠囊樣品測(cè)定 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5 μL，按上述色譜條件測(cè)定，樣品測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 3批新安軟膠囊樣品中水飛薊賓測(cè)定結(jié)果Tab.2 Determination results of silybin in three batches of Xin'an Soft Capsules samples

2.3 薄層鑒別［9］稱取本品內(nèi)容物1.0 g，置于25 mL量瓶中加甲醇適量，超聲使分散溶解，并用甲醇定容至刻度，靜置，取上清液作為供試品溶液;依法制備缺水飛薊賓空白樣品溶液;另取水飛薊賓對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法 (附錄ⅥB)實(shí)驗(yàn)，吸取上述供試品溶液與對(duì)照品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-甲酸乙酯-甲酸 (8∶6∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，見圖4。

圖4 3批新安軟膠囊樣品TLC鑒別圖Fig.4 TLC identification picture of three batches of Xin'an Soft Capsules samples

3 討論

3.1 GC檢測(cè)方法的改進(jìn) 對(duì)文獻(xiàn)［3］的方法進(jìn)行了改進(jìn)，即升高氫焰離子化檢測(cè)器的溫度、增大載氣流量、增加燃?xì)馀c助燃?xì)獾牧髁?，使分析檢測(cè)時(shí)間縮短了30min，節(jié)約了分析成本。因此，可以用作本品定量檢測(cè)指標(biāo)。

3.2 水飛薊賓的測(cè)定 參考文獻(xiàn)［9］，使用流動(dòng)相甲醇-水-冰醋酸 (48∶52∶1與50∶50∶0.5)時(shí)，水飛薊賓及其對(duì)映體分離度小，且理論塔板數(shù)小于5 000;使用流動(dòng)相甲醇-1%冰醋酸 (50∶50)時(shí)，分離度大于1.5，理論塔板數(shù)大于5 000，且陰性無干擾。因此，可以用作本品定量檢測(cè)指標(biāo)。

3.3 水飛薊賓的TLC鑒別 參考文獻(xiàn)［10］，對(duì)新安軟膠囊中水飛薊賓的定性鑒別，使用甲苯-甲酸乙酯-甲酸(10∶6∶1)為展開劑，展開一次，結(jié)果Rf值小于0.3;使用甲苯-甲酸乙酯-甲酸 (8∶6∶1)時(shí)，Rf值大于0.5，供試品色譜中在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同的顏色斑點(diǎn)，在與陰性對(duì)照相應(yīng)位置上無斑點(diǎn)，專屬性強(qiáng)，可以作為本品定性檢測(cè)指標(biāo)。

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