HPLC-UV-MS法同時測定痹祺膠囊中7個有效成分

經(jīng)雅昆， 江振作， 劉亞男， 王躍飛

(天津市中藥化學(xué)與分析重點實驗室，天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193)

痹祺膠囊源于漢代名醫(yī)華佗的傳世驗方“一粒仙丹”，1983年天津達(dá)仁堂制藥二廠在該秘方的基礎(chǔ)上結(jié)合現(xiàn)代科技重新組方，研制出抗風(fēng)除濕新藥——痹祺膠囊。痹祺膠囊是由馬錢子、川芎、甘草、丹參、白術(shù)、三七、黨參等十味中藥組成的復(fù)方制劑，具有益氣養(yǎng)血，祛風(fēng)除濕，活血止痛之功效，臨床用于氣血不足，風(fēng)濕阻滯，肌肉關(guān)節(jié)酸痛，關(guān)節(jié)僵硬變形等風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肩周炎、頸椎病、腰椎間盤突出癥等疾病［1］。方中馬錢子苦寒，具有散結(jié)消腫，通絡(luò)止痛之功［2］，士的寧和馬錢子堿是其主要有效成分;丹參活血化瘀、通絡(luò)止痛［3-6］，主要成分為丹酚酸B、丹參酮ⅡA和隱丹參酮;甘草調(diào)和諸藥［7］，甘草苷和甘草酸為其主要成分。目前，大多數(shù)文獻(xiàn)主要圍繞痹祺膠囊的藥理、毒理作用和臨床應(yīng)用開展研究工作［8］，痹祺膠囊質(zhì)量控制方面的研究文獻(xiàn)報道較少，主要以痹祺膠囊中士的寧、馬錢子堿和丹酚酸B為檢測指標(biāo)開展質(zhì)量控制研究［9-10］。本研究在此基礎(chǔ)上建立了一種同時測定痹祺膠囊中士的寧、馬錢子堿、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、隱丹參酮和丹參酮ⅡA7個活性成分含有量的方法，能夠更全面地評價痹祺膠囊的質(zhì)量。

1 儀器與試劑

Finnigan LCQ Deca XPplus質(zhì)譜儀 (美國 Finnigan公司)，Agilent 1100型高效液相色譜儀 (美國Agilent公司)，由二極管陣列檢測器 (DAD)、柱溫箱、四元梯度泵、自動進(jìn)樣器、在線真空脫氣機(jī)組成，Agilent ChemStation數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);BP121S萬分之一天平 (德國塞多利斯公司);METTLER TOLEDO AX205(瑞士)十萬分之一天平;KQ—250E型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司);2—16A高速離心機(jī) (美國Tomos公司)。

對照品士的寧 (批號:110705-200306)、馬錢子堿 (批號:110706-200505)、甘草苷 (批號:111610-201005)、丹 酚 酸 B(批 號:111562-200908)、隱丹參酮 (批號:110852-200305)和丹參酮ⅡA(批號:110766-200619)均購于中國食品藥品檢定研究院，甘草酸購自天津中新藥業(yè)研究中心，藁本內(nèi)酯購自天津馬克生物技術(shù)有限公司，純度≥98%。

7個批次的痹祺膠囊由天津達(dá)仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司提供。

甲醇和乙腈 (色譜純，MEREK);甲酸 (色譜純，TEDIA);Millipore超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 液相色譜、質(zhì)譜條件 Agilent Zorbax C18色譜柱 (4.6 mm×100 mm，1.8 μm);以乙腈 (A)-0.1%甲酸水溶液 (B)為流動相，梯度洗脫 (0～50 min，7% ～85%A);體積流量0.5 mL/min;檢測波長為260 nm(0～16 min)，286 nm(16.01～23 min，250 nm(23.01 ～28min)，278nm(28.01～40 min)，270 nm(40.01～50 min);柱溫40℃;進(jìn)樣量5 μL。

離子檢測模式為0～14 min:正離子檢測模式;14～28 min:負(fù)離子檢測模式;28～50 min:正離子檢測模式;ESI噴霧電壓 ±4.5 kV;鞘氣 (N2)壓力為276kPa;輔助氣 (N2)體積流量3.3 L/min;毛細(xì)管溫度350℃;毛細(xì)管電壓 ±19 V;掃描范圍m/z100～850 amu。

2.2 對照品貯備液的制備 精密稱取士的寧、馬錢子堿、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、藁本內(nèi)酯、隱丹參酮和丹參酮ⅡA對照品適量，置于棕色量瓶中，加甲醇配制成每1 mL含士的寧、馬錢子堿、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、藁本內(nèi)酯、隱丹參酮和丹參酮ⅡA分別為 0.84、1.10、0.68、1.01、1.02、1.06、1.26、1.00 mg的對照品貯備液，于4℃保存。

2.3 供試品溶液的制備 取痹祺膠囊粉末0.5 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入75%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，放至室溫后，再次稱質(zhì)量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，14 000 r/min離心10 min，取上清液即得供試品溶液。

2.4 陰性樣品溶液的制備 取痹祺膠囊中除馬錢子、川芎、丹參和甘草以外的其他藥材，按處方劑量及制法和工藝要求制備缺馬錢子、川芎、丹參和甘草的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法，制得陰性樣品溶液。

2.5 化合物的定性分析 在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下，取痹祺膠囊的對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液進(jìn)樣分析，得到痹祺膠囊8個成分混合對照品色譜圖 (圖1-A)、供試品色譜圖 (圖1-B)、陰性樣品色譜圖 (圖1-C)及痹祺膠囊供試品的質(zhì)譜總離子流 (TIC)圖 (圖1-D)。由圖1-C可知陰性樣品對士的寧、馬錢子堿、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、隱丹參酮和丹參酮ⅡA的測定無干擾，對藁本內(nèi)酯 (圖1中峰a)的測定有干擾，舍去藁本內(nèi)酯。由圖1-B可知，供試品中被測成分與相鄰組分的分離度R＞1.5，達(dá)到基線分離。通過比較痹祺膠囊供試品和對照品的色譜保留時間(tR)和ESI(+/-)MS數(shù)據(jù)，確定色譜峰1～7分別為士的寧、馬錢子堿、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、隱丹參酮和丹參酮ⅡA。7個化合物的質(zhì)譜信息見表1。

圖1 對照品 (A)、供試品 (B)、陰性樣品 (C)HPLC色譜圖及供試品 (D)TIC圖Fig.1 Chromatograms of mixed reference substances(A)，sample(B)，negative sample(C)and total ion-current chromatogram of sample(D)

表1 痹祺膠囊樣品中7個化學(xué)成分的ESI(+/－)MS數(shù)據(jù)Tab.1 Data of ESI(+/－)MS of seven components in Biqi Capsules

2.6 線性關(guān)系、定量限、檢測限試驗 分別準(zhǔn)確移取2.2項各對照品貯備液適量，置于同一10 mL量瓶中，用甲醇稀釋得士的寧、馬錢子堿、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、隱丹參酮和丹參酮ⅡA質(zhì)量濃度分別為 61.48、32.93、113.1、228.5、271.4、3.353、6.653 μg/mL 的混合對照品溶液，并逐級稀釋成一系列不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，進(jìn)樣5 μL測定。以對照品質(zhì)量濃度X(μg/mL)對峰面積Y進(jìn)行線性回歸。以信噪比3∶1為檢測限，以信噪比10∶1為定量限，按2.1項所述色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果見表2，7個化合物在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 7個化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢測限和定量限Tab.2 Regression equations，correlation coefficients，linear ranges，LODs and LOQs of seven components in Biqi Capsules

2.7 精密度試驗 按2.3項下方法制備供試品溶液，2.1項所述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次測定，連續(xù)進(jìn)樣3 d，記錄士的寧、馬錢子堿、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、隱丹參酮和丹參酮ⅡA的峰面積，計算7個成分的日內(nèi)精密度和日間精密度，結(jié)果見表3。表明精密度良好。

表3 7個化合物的日內(nèi)精密度 (n=6)和日間精密度 (n=3)Tab.3 RSD values of intra-day and inter-day precision of seven components

2.8 穩(wěn)定性試驗 按2.3項下方法制備供試品溶液，2.1項所述色譜條件分別于0、3、6、9、12 h進(jìn)樣5 μL測定，考察供試品溶液的穩(wěn)定性。士的寧、馬錢子堿、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、隱丹參酮和丹參酮ⅡA峰面積的RSD值分別為0.37%、0.57%、 0.46%、 0.36%、 0.30%、 1.66%、0.80%。結(jié)果表明供試品溶液室溫放置12 h基本穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗 按2.3項下方法制備供試品溶液，平行處理6份，在2.1項所述色譜條件下每份連續(xù)進(jìn)樣2次測定，記錄士的寧、馬錢子堿、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、隱丹參酮和丹參酮ⅡA的峰面積，計算質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.756 2、0.514 8、1.190、2.671、3.694、0.041 9、0.086 9 mg/g;RSD值分別為2.04%、1.86%、0.87%、1.00%、0.81%、2.14%、1.26%。表明本方法重復(fù)性好。

2.10 加樣回收率試驗 取痹祺膠囊藥粉0.25 g，精密稱定，共6份，準(zhǔn)確加入與樣品中含有量相當(dāng)?shù)氖康膶?、馬錢子堿、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、隱丹參酮和丹參酮ⅡA對照品貯備液，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項所述色譜條件分別每份連續(xù)進(jìn)樣2次測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表4。

表4 7個化合物加樣回收率試驗結(jié)果 (n=6)Tab.4 Average recoveries of seven components(n=6)

2.11 樣品測定 另取7個批次的痹祺膠囊。按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定。計算痹祺膠囊中7個化學(xué)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表5。結(jié)果表明:痹祺膠囊中有毒成分士的寧和馬錢子堿在制劑中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較穩(wěn)定;丹酚酸B和甘草酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對較高，隱丹參酮和丹參酮ⅡA質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對偏低。

表5 痹祺膠囊中7個化學(xué)成分測定結(jié)果(±s，n=3)Tab.5 Content of seven components in seven batches of Biqi Capsules(±s，n=3)

表5 痹祺膠囊中7個化學(xué)成分測定結(jié)果(±s，n=3)Tab.5 Content of seven components in seven batches of Biqi Capsules(±s，n=3)

批次 士的寧/(mg·g-1)馬錢子堿/(mg·g-1)甘草苷/(mg·g-1)丹酚酸B/(mg·g-1)甘草酸/(mg·g-1)隱丹參酮/(mg·g-1)丹參酮ⅡA/(mg·g-1)1 0.890±0.040 0.569±0.004 0.771±0.060 4.435±0.123 1.786±0.033 0.038±0.001 0.110±0.004 2 0.840±0.040 0.546±0.001 0.693±0.001 2.446±0.016 3.300±0.022 0.247±0.001 0.354±0.002 3 0.790±0.040 0.593±0.006 0.753±0.007 2.982±0.011 3.477±0.008 0.224±0.001 0.317±0.001 4 0.881±0.040 0.566±0.003 0.723±0.003 2.884±0.012 3.344±0.008 0.260±0.002 0.355±0.001 5 0.870±0.040 0.559±0.007 0.744±0.003 2.977±0.026 3.466±0.032 0.259±0.001 0.357±0.001 6 0.819±0.040 0.525±0.012 1.004±0.012 3.188±0.030 2.414±0.037 0.226±0.003 0.320±0.003 7 0.840±0.040 0.541±0.003 0.986±0.001 3.116±0.008 2.438±0.007 0.225±0.001 0.317±0.001 RSD/% 4.32 3.98 15.82 19.58 23.22 37.00 28.81

3 討論

3.1 提取條件的選擇 采用單因素循環(huán)的方法，分別考察了提取溶劑 (50%、75%、100%甲醇)、提取溶劑倍數(shù) (50倍、100倍、200倍)、提取時間 (10、20、30、60 min)的提取效率。綜合考慮提取效率和溶劑用量，選擇50倍量75%甲醇超聲提取30 min。

3.2 檢測指標(biāo)的選擇 馬錢子在處方中起著重要作用，具有通絡(luò)止痛、散結(jié)消腫的功效。士的寧和馬錢子堿既是其中主要有效成分，也是有毒成分［11-12］，因此士的寧和馬錢子堿是痹祺膠囊質(zhì)量控制的關(guān)鍵指標(biāo)。丹參活血化瘀、通絡(luò)止痛，主要成分為丹酚酸B、丹參酮ⅡA和隱丹參酮;甘草調(diào)和諸藥，甘草苷和甘草酸為其主要成分。綜上所述，本實驗選取士的寧、馬錢子堿、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、隱丹參酮和丹參酮ⅡA作為檢測指標(biāo)，能更全面反映痹祺膠囊的質(zhì)量，保證臨床用藥的安全性和有效性。

3.3 檢測波長的選擇 由于本實驗選取的7個檢測指標(biāo)的最大吸收波長不同，因此為了達(dá)到檢測靈敏度高、干擾小且真實反映痹祺膠囊各個有效成分含有量的目的，采用波長切換的方法。結(jié)合各化合物的最大吸收波長和出峰時間，利用二級陣列管檢測器波長切換的功能，確定了檢測波長。

3.4 質(zhì)譜離子模式的選擇 由于本實驗選取的7個檢測指標(biāo)在正、負(fù)離子模式的響應(yīng)不同:士的寧、馬錢子堿、甘草苷、隱丹參酮和丹參酮ⅡA在正離子檢測模式下響應(yīng)高;丹酚酸B、甘草酸在負(fù)離子檢測模式下響應(yīng)高，最終確定離子檢測模式為0～14 min:正離子檢測模式;14～28 min:負(fù)離子檢測模式;28～50 min:正離子檢測模式。

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