BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模擬環(huán)維黃楊星D經(jīng)皮滲透行為的研究

劉新國， 周莉玲， 鄒吉利， 吳金虎*

(1.武漢市第三醫(yī)院，湖北武漢 430061;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510006)

黃楊寧系從黃楊科植物中國小葉黃楊Buxus microphyllaSieb.et Zucc.varsinicaRehd.et Wils.及其同屬植物中提取得到的生物堿，其主要有效成分環(huán)維黃楊星D(Cyclovirobuxine D，CVB-D)是中國藥典2010版一部收載的品種，具有行氣活血、通絡(luò)止痛的藥理作用，臨床用于治療氣滯血瘀所致的胸痹心痛、脈結(jié)代、冠心病、心律失常等［1-2］。環(huán)維黃楊星D屬孕甾烷衍生物［3］，相對分子質(zhì)量402，熔點 219～222℃，正辛醇/水分配系數(shù)2.468，口服日劑量在5 mg以內(nèi)，這些特點均符合制備經(jīng)皮給藥制劑的基本要求［4-5］，因此對環(huán)維黃楊星D的體外經(jīng)皮滲透行為進(jìn)行研究，不僅可以探討該藥的透皮機制，更有助于經(jīng)皮給藥制劑的開發(fā)。

1 試藥、儀器與動物

1.1 試藥 環(huán)維黃楊星D對照品，批號為888-200001，中國藥品生物制品檢定所;環(huán)維黃楊星D透皮貼劑，規(guī)格分別為0.25、0.5、1.0、2.0 mg/cm2，自制;異氰酸苯酯，化學(xué)純，中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司;甲醇，色譜純，德國Merck公司;其它均為市售分析純試劑。

1.2 儀器 Summit P680型高效液相色譜儀，德國dionex公司，包括P680泵、UVD170U可變波長紫外檢測器、Chromeceon色譜工作站;TK—12B型透皮擴散試驗儀，上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司;TDL—5000B型低速冷凍多管離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠;BP211D型電子分析天平，德國Sartorius公司;HS6510D超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試驗動物 健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量 (200±20)g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)試驗動物中心提供，合格證號:SCXK(粵)2009-0001。

2 HPLC測定經(jīng)皮滲透樣品中環(huán)維黃楊星D含有量

2.1 色譜條件［6-8］Phenomenex Hyperclone BDS C18色譜柱 (250 mm×4.00 mm，5 μm)，美國菲羅門公司;流動相為甲醇-水 (85∶15);體積流量1.0 mL/min;柱溫為室溫;進(jìn)樣量10 μL;檢測波長為240 nm，理論塔板數(shù)按環(huán)維黃楊星D峰計算不得低于3 000。

2.2 試液的配制 對照品溶液的制備:精密稱取環(huán)維黃楊星D對照品適量，以20%乙醇/生理鹽水溶液配成每1 mL含環(huán)維黃楊星D 191.4 μg的溶液，搖勻，即得。

供試品溶液的制備:精密吸取經(jīng)皮滲透接受液0.6 mL，用24%氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至堿性，加入三氯甲烷3 mL，渦旋振蕩30 s后3 000 r/min離心10 min。精密吸取下層三氯甲烷液2 mL，加衍生化試劑60 μL，搖勻后避光放置30 min，在40℃水浴中N2流下?lián)]干，殘渣用甲醇1.0 mL溶解，0.45 μm有機系微孔濾膜濾過，即得。

陰性對照溶液的制備:將鼠皮用空白接受液浸泡6 h后，經(jīng) 0.45 μm有機系微孔濾膜濾過，即得。

2.3 方法專屬性考察 精密吸取陰性對照溶液0.6 mL，參照2.2項下供試品溶液制備方法，按上述色譜條件進(jìn)樣分析。由圖1可以看出鼠皮溶出物對環(huán)維黃楊星D測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取對照品溶液10、20、40、60、80、100、200 μL于10 mL具塞玻璃離心管中，參照2.2項下供試品溶液制備方法操作，按上述色譜條件測定供試品中環(huán)維黃楊星D含有量。以進(jìn)樣量 (Q)對峰面積積分值 (A)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=52.229Q+0.458(r=0.999 0)。結(jié)果表明進(jìn)樣量在0.019 14～0.382 8 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 萃取回收率測定 精密吸取環(huán)維黃楊星D對照品溶液40、200、400 μL于10 mL玻璃離心試管中，40℃水浴N2流下?lián)]干，加入空白接收液0.6 mL，參照2.2項下供試品溶液制備方法操作，按上述色譜條件進(jìn)樣分析。同時精密吸取環(huán)維黃楊星D對照品溶液40、200、400 μL于10 mL離心試管中，各加衍生化試劑60 μL，搖勻后避光放置30 min，在40℃水浴中N2吹干，殘渣用甲醇1.0 mL溶解，0.45 μm微孔濾膜過濾，進(jìn)樣分析，計算萃取回收率，結(jié)果見表1。

表1 萃取回收率考察結(jié)果Tab.1 Recovery of extraction method

3 經(jīng)皮滲透試驗

3.1 經(jīng)皮滲透試驗操作 采用Franz透皮擴散池裝置 (接受池體積6.5 mL，接受池有效接觸面積2.8 cm2)進(jìn)行環(huán)維黃楊星D透皮貼劑體外經(jīng)皮滲透試驗。固定裝置，將接收介質(zhì)加入接受池，取脫毛預(yù)處理的大鼠腹皮，將真皮層一側(cè)面向接受池，確保無氣泡存在，剪去多余皮膚，將環(huán)維黃楊星D透皮貼劑緊貼于離體鼠皮角質(zhì)層一側(cè)，頂端用塑料薄膜密封。另取一套Franz裝置，同法操作，將不含藥物的貼劑緊貼于離體鼠皮角質(zhì)層一側(cè)，作為空白對照。水浴恒溫至 (37±1)℃，電磁恒速攪拌(200 r/min)，分別于 1、2、4、6、8、10、12、14、16 h取樣，每次取接受液5.0 mL，并立即補充5.0 mL空白接收液。接受液經(jīng)處理后，用0.45 μm微孔濾膜濾過，HPLC測定環(huán)維黃楊星D含有量。

按以下公式計算單位面積累積釋放量 (Q，μg/cm2)

式中，Cn:第n個取樣點測得的藥物質(zhì)量濃度(μg/mL);Ci:第i(i=n-1)個取樣點測得的藥物質(zhì)量濃度 (μg/mL);A:有效擴散面積(cm2)。

3.2 不同載藥量環(huán)維黃楊星D透皮貼劑的體外經(jīng)皮滲透實驗 將含藥量分別為0.25、0.5、1.0、2.0 mg/cm2單層貼劑參照3.1項下方法進(jìn)行透皮試驗，每個藥物濃度平行操作6次，按HPLC檢測接收液中環(huán)維黃楊星D含有量，結(jié)果見表2。

表2 環(huán)維黃楊星D貼劑體外經(jīng)皮滲透試驗結(jié)果 (±s，n=6)Tab.2 Result of skin permeation study of cyclovirobuxine D patch in vitro(±s，n=6)

表2 環(huán)維黃楊星D貼劑體外經(jīng)皮滲透試驗結(jié)果 (±s，n=6)Tab.2 Result of skin permeation study of cyclovirobuxine D patch in vitro(±s，n=6)

時間/h Q(μg·cm-2)/%0.25/(mg·cm-2) 0.5/(mg·cm-2) 1.0/(mg·cm-2) 2.0/(mg·cm-2)1 2.06±0.98 3.51±0.85 4.20±0.34 4.57±1.39 2 4.49±1.45 7.27±1.32 9.38±0.90 9.99±2.14 4 12.31±2.30 18.91±2.40 25.31±2.29 26.16±2.52 6 27.00±3.32 39.84±4.37 52.35±4.04 56.81±3.72 8 38.17±3.32 55.05±5.56 73.72±5.28 84.36±3.66 10 47.55±3.67 68.70±6.14 92.35±6.38 107.74±4.92 12 62.71±4.31 88.62±8.29 117.62±7.69 145.68±6.19 14 77.48±5.30 108.09±9.87 145.09±7.80 179.06±7.86 16 97.17±5.77 134.80±12.30 181.51±7.39 227.31±11.39

對表2數(shù)據(jù)以單位面積累積透皮量 (Q，μg/cm2)對時間 (t，h)分別按零級、一級以及Higuchi動力學(xué)方程進(jìn)行擬合，并計算透皮速率常數(shù)J(μg/(cm2·h))，結(jié)果見表3，圖2。

表3 環(huán)維黃楊星D貼劑經(jīng)皮滲透動力學(xué)參數(shù)Tab.3 Transdermal permeation parameters of cyclovirobuxine D patch(n=6)

由表3結(jié)果可知，4個藥物濃度貼劑的體外經(jīng)皮滲透行為均以零級動力學(xué)方程擬合為優(yōu)，表明貼劑中藥物透過皮膚是一個被動擴散過程，在0.25～2.0 mg/cm2藥物濃度范圍內(nèi)，貼劑累積透過量隨濃度增大而增加。

圖2 不同藥物濃度環(huán)維黃楊星D貼劑經(jīng)皮滲透動力學(xué)擬合曲線Fig.2 The percutaneous penetration curves of different concentrations of cyclovirobuxine D patch

4 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測環(huán)維黃楊星D經(jīng)皮滲透行為的研究

4.1 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的建立 本研究BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析單元實現(xiàn)。選取3個不同藥物濃度 (0.25、0.50、2.0 mg/cm2)環(huán)維黃楊星D貼劑9個時間點累積透皮量為建模數(shù)據(jù)，每個藥物濃度經(jīng)皮滲透試驗平行操作6次，以貼劑藥物濃度作為輸入神經(jīng)元，各時間點的累積透過量作為輸出神經(jīng)元，隨機選取80%的數(shù)據(jù)來訓(xùn)練模型，20%的數(shù)據(jù)來測試模型，建立一個三層BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。

4.2 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練與優(yōu)化 根據(jù)公式 (1)及公式 (2)初步確定隱層神經(jīng)元個數(shù)的范圍:

其中，k為訓(xùn)練樣本個數(shù)，m為隱層神經(jīng)元個數(shù)，n為輸入神經(jīng)元個數(shù)，l為輸出神經(jīng)元個數(shù)，a為 ［1，10］之間的常數(shù)。本研究中k為18，n為1，l為9，故確定m為 ［5，13］之間的常數(shù)。經(jīng)過多次BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)循環(huán)運行，得到在不同隱層神經(jīng)元個數(shù)時訓(xùn)練樣本的Q值，用Q值擬合值對實測值進(jìn)行線性回歸，以回歸方程斜率及相關(guān)系數(shù)的平方越接近于1，截距越接近于0為依據(jù)，選擇隱藏層神經(jīng)元個數(shù)為6。

4.3 訓(xùn)練樣本與測試樣品比例的選擇 在建立神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)過程中，訓(xùn)練樣本是用于訓(xùn)練神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)記錄，數(shù)據(jù)必須按百分比分配給訓(xùn)練樣本以獲得一個模型。測試樣本是用于跟蹤訓(xùn)練過程中的錯誤以防止超額訓(xùn)練的獨立數(shù)據(jù)記錄集。預(yù)測值的誤差反映神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測能力的“真實”估計值，但預(yù)測值不用于構(gòu)建模型。因此，對訓(xùn)練樣本與測試樣本的比例進(jìn)行調(diào)整，將預(yù)測值與實測值進(jìn)行比較，計算擬合度，結(jié)果見表4。

表4 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型采用不同比例訓(xùn)練樣本的擬合精度Tab.4 The fitting accuracy of different proportion of training samples in neural network model

表4結(jié)果顯示，以80%的數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練樣本，20%的數(shù)據(jù)作為檢測樣本，模型的擬合精度較高，將其作為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建參數(shù)。

4.4 擬合精度的比較 利用建立好的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測另外一個藥物濃度貼劑 (C=1.0 mg/cm2)的體外經(jīng)皮滲透過程 (結(jié)果見表5)，將預(yù)測結(jié)果與實測數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，得出其線性方程:Y=0.992 1X+0.931 8，r=0.998 9，具有較高的預(yù)測精度。

表5 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的預(yù)測結(jié)果及其擬合精度Tab.5 Neural network prediction results and fitting accuracy

將環(huán)維黃楊星D透皮貼劑全部4個藥物濃度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型所得擬合度與經(jīng)典動力學(xué)方程擬合度進(jìn)行比較，結(jié)果見表6。

表6 不同方法的擬合精度比較Tab.6 Comparison offitting accuracy ofdifferent fitting methods

從表6可以看出，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型比較經(jīng)典動力學(xué)方程擬合方法，前者具有較高的擬合度。傳統(tǒng)擬合計算方法，一個經(jīng)典動力學(xué)方程只能反映一個藥物濃度制劑經(jīng)皮滲透情況，不能用于其他藥物濃度透皮行為的計算，而建立神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型可以用于多個藥物濃度經(jīng)皮滲透行為的模擬與預(yù)測，本研究探討了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)用于藥物經(jīng)皮滲透行為預(yù)測的可行性，以及相比經(jīng)典動力學(xué)方程擬合方法的優(yōu)越性。

5 討論

生物現(xiàn)象從本質(zhì)上看是非線性的，物理化學(xué)和基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)參數(shù)對生物活性的影響也是非線性的，人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)廣泛的適應(yīng)能力和學(xué)習(xí)能力對于非線性系統(tǒng)的預(yù)測非常重要。傳統(tǒng)藥物體外經(jīng)皮滲透研究都是依賴于模型進(jìn)行的，即按各種已知模型對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，再根據(jù)得到的結(jié)果反過來對摸型進(jìn)行校正，這需要做大量的工作［9-11］。如經(jīng)皮給藥系統(tǒng)的研究采用體外經(jīng)皮滲透試驗來模擬在體透皮過程，其經(jīng)皮滲透動力學(xué)過程常采用零級擬合、Higuchi擬合、一級擬合等方式進(jìn)行，但由于制劑本身因素和皮膚多層組織結(jié)構(gòu)因素對透皮效果產(chǎn)生影響［12］，而且部分透皮影響因素尚不明確，因此公式擬合方法存在一定的局限。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的特點在于不需事先假定一個特定的模型，只需從提供的數(shù)據(jù)中學(xué)習(xí)，并建立輸入與輸出的關(guān)系，可極大簡化傳統(tǒng)分析方法所需建模工作。本研究采用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)相關(guān)理論進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合與上述公式擬合結(jié)果進(jìn)行比較，初步探討了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)用于藥物經(jīng)皮滲透行為預(yù)測的可行性。

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