黃芪葛根湯對糖尿病心肌病大鼠氧化應(yīng)激和NF-κB表達(dá)的影響

陳艷芬， 王春怡， 李衛(wèi)民， 高 英*， 唐春萍， 楊超燕， 薛秀敏

(1.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣東廣州 510006;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006)

糖尿病并發(fā)癥發(fā)病的統(tǒng)一機制學(xué)說認(rèn)為，在持續(xù)高糖狀態(tài)下，線粒體活性氧簇 (ROS)生成增加可能是糖尿病各種并發(fā)癥發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，氧自由基生成增多導(dǎo)致的氧化應(yīng)激既是糖尿病微血管病變發(fā)生、發(fā)展的重要影響因素，也是導(dǎo)致心肌損傷的重要因素［1］。因此針對糖尿病抗氧化治療的臨床與動物研究成為糖尿病及其慢性并發(fā)癥預(yù)防與治療用藥的重要評價手段［2］。黃芪葛根湯方源自古籍，益氣健脾，滋陰清熱，生津止渴，前期通過鏈脲佐菌素 (STZ)糖尿病和氫化可的松胰島素抵抗小鼠實驗證實其具有改善胰島素抵抗、降血糖作用;在病理觀察中發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠病程持續(xù)一段時間后心肌線粒體增多異常明顯，線粒體腫脹變性，嵴斷裂、溶解，形成空泡區(qū)，黃芪葛根湯能明顯改善心肌超微結(jié)構(gòu)。因此，為進一步探討該方對糖尿病心肌病的保護作用及機制，本研究通過建立2型糖尿病心肌病大鼠模型，觀察黃芪葛根湯對心肌氧化應(yīng)激和NF-κB表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級SD雄性大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號:SCXK(粵)2003—0002，粵監(jiān)證字2008A020，飼養(yǎng)環(huán)境符合醫(yī)學(xué)實驗動物環(huán)境設(shè)施要求。

1.1.2 藥物與試劑 黃芪葛根湯由黃芪、葛根等組成，其浸膏每1 g相當(dāng)于生藥1.71 g，相對密度1.22(50℃)，臨用時用蒸餾水稀釋至所需濃度;鹽酸羅格列酮，貴州圣濟堂制藥有限公司生產(chǎn)，批號:20070502;STZ，美國Sigma公司產(chǎn)品;血糖試劑盒，上海科華生物工程股份有限公司;血脂檢測試劑盒:甘油三脂 (TG)，膽固醇 (TC)，高密度脂蛋白膽固醇 (HDL-C)，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，北京中生北控生物科技股份有限公司;SOD，MDA，GSH-Px和組織蛋白測定試劑盒，南京建成生物工程公司，批號為20080912和20080829?？?RNA提取試劑 Trizol，Invitrogen公司，RT-PCR試劑盒，TIANGEN公司。

1.1.3 主要儀器 AV5421全自動生化分析儀(奧林巴斯公司產(chǎn)品);UV-1800型紫外可見光光度計 (北京瑞利分析儀器公司);AB2700 PCR擴增儀 (美國AB公司);PAC 300電泳儀 (美國BIO-RAD公司);Gel 100凝膠成像系統(tǒng) (美國BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型建立、分組與給藥 大鼠先用高脂高熱量飼料喂養(yǎng)4周 (由基礎(chǔ)鼠料加酪蛋白、蔗糖、豬油等按比例組成，其中基礎(chǔ)鼠料52%，酪蛋白12%，蔗糖10%，豬油24%，磷酸氫鈣2%，復(fù)合多維0.1%，礦物質(zhì)0.4%，鹽0.2%)，再以小劑量STZ 30 mg/kg腹腔注射 (正常對照組同時采用檸檬酸緩沖液腹腔注射)，1周后取血測空腹血糖 (FBG)和糖耐量。選擇糖耐量異常 (2 hBG≥7.8 mmol/L)的60只成模大鼠納入實驗。成模大鼠隨機分成五組 (模型組，羅格列酮組，黃芪葛根湯高、中、低劑量組)，繼續(xù)以高脂飼料喂養(yǎng)8周。正常組10只大鼠一直采用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。每周稱體質(zhì)量1次，記錄體質(zhì)量、進食量、飲水量。采用代謝籠收集大鼠24 h尿液。各組分別按體質(zhì)量灌胃給藥，每天1次，正常組和模型組則予以等體積的蒸餾水，8周后處死動物取材。

1.2.2 標(biāo)本采集與指標(biāo)檢測 末次給藥后禁食12 h，大鼠經(jīng)腹主動脈取血，3 500 r/min，4℃，離心10 min取上清，采用全自動生化分析儀檢測空腹血糖 (FBG)和血脂。參考文獻(xiàn)采用大鼠不禁食狀態(tài)下下午所測得的隨機血糖視為餐后血糖(PBG)。取血后處死大鼠，迅速取出心臟，剪除包膜、血管，取約100 mg左心室肌組織裝入凍存管保存?zhèn)溆?，擇日?～4℃條件下制成100 g/L心肌組織生理鹽水勻漿液，按試劑盒方法測定SOD，MDA，GSH-Px。

1.2.3 RT-PCR檢測心肌組織NF-κB mRNA表達(dá)按Trizol試劑說明提取心肌組織總RNA，取2 μg總RNA進行RT反應(yīng)，然后取RT產(chǎn)物進行NF-κB和內(nèi)參β-actin的PCR反應(yīng)。其中β-actin的上游引物5'-GACCCAGATCATGTTTGAGACC-3'，下游引物5'-GCAGTAATCTCCTTCTGCATCC-3'， 擴 增 產(chǎn) 物600 bp。NF-κB 上游 引物 5'-GGGACTATGACTTGAATGCG-3'，下 游 引 物 5'-CAGGCTAGGGTCAGCGTAT-3'，擴增產(chǎn)物300 bp。NF-κB反應(yīng)體系為:RT反應(yīng)產(chǎn)物1 μL，β-Actin上、下游引物 (5 μmol/L)各 0.5 μL，NF-κB 上、下游引物 (10 μmol/L)各 1 μL ，2 ×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，總體積25 μL。NF-κB 反應(yīng)步驟為:94℃ 5 min 1循環(huán)，94℃ 30、56℃ 30、72℃ 1 min共30循環(huán)，72℃7 min 1循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖膠上電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)進行照相，測定各產(chǎn)物電泳條帶光密度值，計算目的基因光密度和內(nèi)參光密度比值作為NF-κB mRNA的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的一般體征 (體質(zhì)量、進食量、飲水量、尿量)觀察 正常對照組大鼠毛色光亮、潔白，體態(tài)活潑，無多飲、多尿現(xiàn)象，體質(zhì)量逐漸增加。造模大鼠在前4周高脂飼料喂養(yǎng)期體質(zhì)量增加明顯，其它外觀體征與正常組無明顯區(qū)別，但在注射STZ 1周后，體質(zhì)量有所下降，隨著時間的推移體質(zhì)量增加明顯，尤其是模型組大鼠，并出現(xiàn)明顯的多飲、多食、多尿。經(jīng)過各組藥物干預(yù)治療后，大鼠體質(zhì)量、進食量和飲水量有不同程度改善。采用代謝籠收集24 h尿量，糖尿病模型組大鼠與正常對照組比較，尿量顯著升高 (P＜0.01);黃芪葛根湯高、中劑量組、羅格列酮組與模型組相比，尿量顯著降低 (P＜0.05或P＜0.01)，說明黃芪葛根湯、羅格列酮能明顯改善糖尿病多尿癥狀(結(jié)果見表1)。

2.2 黃芪葛根湯對大鼠血糖的影響 由表1可見，與正常組相比，模型組空腹血糖和餐后血糖都顯著升高 (P＜0.01)，說明2型糖尿病模型造模成功。與模型組比較，黃芪葛根湯高、中劑量組，羅格列酮組的空腹血糖明顯降低;黃芪葛根湯中劑量組、羅格列酮組的餐后血糖也明顯降低。

表1 黃芪葛根湯對糖尿病心肌病大鼠血糖和尿量的影響Tab.1 Effects of Huangqi Gegen Decoction on blood glucose and urinary volume in diabetic cardiomyopathy rats(±s，n=8)

表1 黃芪葛根湯對糖尿病心肌病大鼠血糖和尿量的影響Tab.1 Effects of Huangqi Gegen Decoction on blood glucose and urinary volume in diabetic cardiomyopathy rats(±s，n=8)

與正常組比較，▲▲ P＜0.01;與模型組比較＊＊P ＜0.01，*P ＜0.05。

組 別 劑量/(g·kg-1) FBG/(mmol·L-1) PBG/(mmol·L-1) 24 h尿量 (mL·g-1·100-1)正常組-5.55±0.58 7.09±1.56 4.82±1.35模型組 - 15.77±4.28▲▲ 17.14±4.75▲▲ 9.22±4.80▲▲黃芪葛根湯高劑量組 8 11.38±4.28* 12.34±5.27 4.39±1.49*黃芪葛根湯中劑量組 4 11.52±1.39* 11.24±5.11* 4.51±1.60*黃芪葛根湯低劑量組 2 14.36±2.33 14.07±5.65 6.14±3.94羅格列酮組 0.001 8.84±0.65＊＊ 9.74±3.76＊＊ 3.09±1.04＊＊

2.3 黃芪葛根湯對大鼠血脂的影響 表2結(jié)果顯示，與模型組比較，黃芪葛根湯各劑量均可顯著降低模型大鼠的血清TC和LDL-C(P＜0.05～P＜0.01)，黃芪葛根湯高、中劑量還可顯著降低大鼠的TG水平 (P＜0.05)，中劑量明顯升高大鼠的HDL-C水平 (P＜0.05)。說明黃芪葛根湯具有良好的調(diào)血脂作用，有利于治療糖尿病的脂代謝紊亂。

表2 黃芪葛根湯對糖尿病心肌病大鼠血脂的影響Tab.2 Effects of Huangqi Gegen Decoction on blood lipid in diabetic cardiomyopathy rats(±s，n=8)

表2 黃芪葛根湯對糖尿病心肌病大鼠血脂的影響Tab.2 Effects of Huangqi Gegen Decoction on blood lipid in diabetic cardiomyopathy rats(±s，n=8)

與正常組比較，▲▲ P ＜0.01;與模型組比較，＊＊P ＜0.01，*P ＜0.05。

組 別 劑量 /(g·kg-1) TC/(mmol·L-1) TG/(mmol·L-1) HDL-C/(mmol·L-1) LDL-C/(mmol·L-1)正常組 —1.05±0.17 0.65±0.11 0.58±0.03 0.20±0.04模型組 — 1.50±0.10▲▲ 1.50±0.37▲▲ 0.50±0.07▲▲ 0.27±0.04▲▲黃芪葛根湯高劑量組 8 1.24±0.22＊＊ 1.16±0.22* 0.53±0.16 0.19±0.05＊＊黃芪葛根湯中劑量組 4 1.13±0.16＊＊ 1.19±0.31* 0.59±0.13* 0.18±0.02＊＊黃芪葛根湯低劑量組 2 1.38±0.09* 1.22±0.31 0.51±0.13 0.17±0.03＊＊羅格列酮組 0.001 1.37±0.12＊＊ 0.91±0.16＊＊ 0.57±0.03* 0.22±0.05*

2.4 黃芪葛根湯對大鼠心肌SOD、MDA、GSH-Px的影響 表3結(jié)果表明，糖尿病心肌病模型組大鼠心肌SOD和GSH-Px活性顯著低于正常組，MDA顯著高于正常組 (P＜0.01)，提示大鼠心肌存在著過度的氧化應(yīng)激反應(yīng)。而黃芪葛根湯高、中、低劑量組心肌SOD活性都明顯高于模型組，高、中劑量組心肌GSH-Px活性顯著高于模型組，MDA水平明顯低于模型組，提示黃芪葛根湯能明顯提高心肌的抗氧化能力。

表3 黃芪葛根湯對糖尿病心肌病大鼠SOD、MDA、GSH-Px的影響Tab.3 Effects of Huangqi Gegen Decoction on SOD，MDA and GSH-Px in diabetic cardiomyopathy rats(±s，n=9)

表3 黃芪葛根湯對糖尿病心肌病大鼠SOD、MDA、GSH-Px的影響Tab.3 Effects of Huangqi Gegen Decoction on SOD，MDA and GSH-Px in diabetic cardiomyopathy rats(±s，n=9)

與正常組比較，▲▲ P ＜0.01;與模型組比較，＊＊P ＜0.01，*P ＜0.05。

組 別 劑量/(g·kg-1) SOD/(U·mgprot-1) MDA/(nmol·mgprot-1) GSH-Px/(活力單位)正常組-80.85±19.63 3.09±0.46 56.65±9.72模型組 - 55.10±11.25▲▲ 3.77±0.36▲▲ 43.90±10.24▲▲黃芪葛根湯高劑量組 8 77.02±15.64＊＊ 3.23±0.55* 58.37±16.11*黃芪葛根湯中劑量組 4 76.88±9.52＊＊ 3.30±0.59* 57.92±6.94＊＊黃芪葛根湯低劑量組 2 69.90±12.37* 3.53±0.80 52.69±11.89羅格列酮組 0.001 71.58±17.37* 3.27±0.60* 58.47±10.01＊＊

2.5 黃芪葛根湯對大鼠心肌NF-κB mRNA表達(dá)的影響 RT-PCR結(jié)果表明，糖尿病心肌病模型組大鼠的心肌NF-κB mRNA表達(dá)明顯高于正常組(P＜0.05)，而黃芪葛根湯高、中劑量組都能明顯抑制NF-κB mRNA的表達(dá) (P＜0.05)。(見圖1和圖2)

圖1 心肌NF-κB RT-PCR電泳圖Fig.1 Electrophoresis picture of NF-kappa B in myocardium detected by RT-PCR

圖2 心肌NF-κB mRNA表達(dá)比較Fig.2 Expression level of NF-kappa B in myocardium(±s，n=6)

3 討論

糖尿病是一種由多種原因引起的糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂綜合征，這種代謝的紊亂可引起心肌細(xì)胞的能量代謝障礙，最終導(dǎo)致心臟功能和結(jié)構(gòu)的異常。目前糖尿病心肌病作為糖尿病的一種獨特的并發(fā)癥已經(jīng)得到國內(nèi)外學(xué)者的公認(rèn)［3-7］，但由于本病隱匿性較強，容易被漏診或誤診，因此一旦發(fā)現(xiàn)，病情嚴(yán)重復(fù)雜，治療矛盾多，預(yù)后較差，如果能在疾病的早期采取干預(yù)措施將對本病產(chǎn)生積極的影響。中藥黃芪、葛根對糖尿病、心血管疾病均有較好的治療效果，且二者作為藥對配伍應(yīng)用于糖尿病及并發(fā)癥的治療歷史悠久。為探討黃芪葛根湯對糖尿病心肌的保護作用，通過復(fù)合因素建立和臨床特征相似的2型糖尿病心肌病大鼠模型，已證實該模型具有明顯的多飲、多食、多尿、糖脂代謝紊亂以及糖尿病心肌病的典型病理特征為心肌細(xì)胞肥大、凋亡、灶性壞死，心肌間質(zhì)纖維化。本研究主要探討該方對糖尿病大鼠血糖、血脂、心肌氧化應(yīng)激和NF-κB表達(dá)的影響。

高血糖是糖尿病最基本的病理特征，也是引起糖尿病一些慢性并發(fā)癥的重要原因。脂質(zhì)代謝紊亂既可加重糖代謝紊亂，又可使糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生率及病死率明顯增高。因此，積極采取降糖降脂措施有利于2型糖尿病及其并發(fā)癥的治療。本研究證實，黃芪葛根湯能明顯降低大鼠空腹血糖和餐后血糖，而且具有良好的調(diào)節(jié)血脂作用，說明該方的長期應(yīng)用將有利于代謝綜合征的防治。

2型糖尿病病人存在氧化應(yīng)激的增強已被國內(nèi)外許多研究證實，在持續(xù)高糖狀態(tài)下，ROS生成增加可能是糖尿病各種并發(fā)癥發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。同時，異常的脂質(zhì)代謝所產(chǎn)生的具有毒性的氧化型LDL在體內(nèi)的大量蓄積，使細(xì)胞引起TNF-α和IL-6等增加，氧化應(yīng)激反應(yīng)增強，加重了心肌細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，最終導(dǎo)致糖基化終末產(chǎn)物(AGES)在微血管內(nèi)膜、周膜以及心肌間質(zhì)沉積并與膠原蛋白交聯(lián)導(dǎo)致纖維化。近年的研究表明，氧化應(yīng)激還與心肌細(xì)胞凋亡有著極其密切的關(guān)系。由此可知氧化應(yīng)激在糖尿病心肌病變過程中扮演著非常重要的角色。

在缺乏抗氧化物的有效補充的情況下，氧化應(yīng)激逐漸加重，進一步導(dǎo)致各種相關(guān)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的激活，包括NF-κB。NF-κB是一種廣泛存在于體內(nèi)多種細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄因子，被稱為炎癥反應(yīng)鏈的“基因開關(guān)”，參與許多細(xì)胞因子的表達(dá)調(diào)控，在機體的炎癥反應(yīng)、凋亡調(diào)控、免疫等方面發(fā)揮重要作用。糖尿病時蛋白質(zhì)的非酶糖化、AGES和其特異受體結(jié)合、氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS等均可激活NF-κB［8］，激活的 NF-κB 可啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄(TNF-α、TGF-β1 等)［9］。

本研究結(jié)果顯示，糖尿病心肌病模型大鼠心肌MDA顯著增高，SOD、GSH-Px活性顯著降低，證實了氧化應(yīng)激性損傷與糖尿病心肌病的發(fā)病關(guān)系密切，而且心肌組織NF-κB表達(dá)明顯增強。黃芪葛根湯能明顯增強心肌內(nèi)抗氧化酶活性及減少脂質(zhì)過氧化，抑制糖尿病心肌NF-κB表達(dá)，從而預(yù)防或延緩心肌病變的發(fā)生，對糖尿病心肌發(fā)揮保護作用。

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