大豆小分子肽生物學(xué)功能效果評價(jià)

李茂輝，李碩，郭紅，閻萍

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系衛(wèi)生檢驗(yàn)中心，遼寧沈陽 110034；2.昆明理工大學(xué)生物技術(shù)研究中心，云南昆明 650224；3.沈陽二四二醫(yī)院，遼寧沈陽 110034）

自1902年英國科學(xué)家Buyliss和Starling在動物的胃腸內(nèi)第一次發(fā)現(xiàn)活性多肽物質(zhì)以來，到現(xiàn)在人們已發(fā)現(xiàn)和分離出100多種存在于生物體內(nèi)的多肽。特別是近30年，隨著生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展和分離檢測水平的提高，對于多肽研究取得巨大的進(jìn)展。人們發(fā)現(xiàn)，多肽物質(zhì)除了具有一般蛋白質(zhì)的營養(yǎng)作用外，對人體還具有非常重要的不可替代的調(diào)節(jié)作用，這種作用幾乎涉及到人體的所有生理活動。例如：神經(jīng)、消化、吸收、代謝、循環(huán)、生長、生殖、內(nèi)分泌等等[1]。

近年來，大豆蛋白產(chǎn)品的開發(fā)利用已受到食品工業(yè)的高度重視。大豆蛋白的乳化性及吸油性等功能特性，已被人們廣泛地接受和認(rèn)識。為了進(jìn)一步提高大豆產(chǎn)品的營養(yǎng)功能和加工特性，提高大豆蛋白產(chǎn)品的利用價(jià)值與附加值，大豆肽的開發(fā)研究已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[2]。

大豆多肽是大豆蛋白經(jīng)水解而制成的低分子肽混合物，無論是理化特性、營養(yǎng)特性還是功能特性都優(yōu)于大豆蛋白質(zhì)。研究表明這些低分子肽具有調(diào)節(jié)血壓、降低膽固醇、促進(jìn)脂肪代謝、提高機(jī)體免疫力、延緩衰老等功能，其應(yīng)用前景非常廣泛，市場潛力巨大[3]。我們采用來源廣泛廉價(jià)的粗胰酶預(yù)處理脫脂大豆餅粕后，再用中性微生物蛋白酶做酶源，研究完成了大豆小分子多肽的實(shí)驗(yàn)室制備工藝和質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)方面的工作，取得了無蛋白質(zhì)變性，無豆腥味，無殘?jiān)?，分子量小，易溶于水，在酸性條件下也不產(chǎn)生沉淀，溶液粘性小和受熱不凝固等特性，它是一種活性小分子肽（分子量300 u～700 u）。本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)驗(yàn)室自己研制的大豆小分子肽，通過動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠硖接懫淇蛊诤涂寡趸纳飳W(xué)功能。為更好地開發(fā)大豆小分子肽提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆餅粕（蛋白質(zhì)含量55.55%）：遼寧省昌圖縣。

粗胰酶（1.93 kat）：由沈陽醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系衛(wèi)生檢驗(yàn)中心自制，工藝流程：采用新鮮胰臟一加2倍水→磨成胰漿→pH5.5的氯化鈣激活劑激活胰漿→乙醇沉淀→室溫干燥→粗胰酶粉→回收乙醇

根據(jù)國家藥典中的測定方法以酪蛋白為底物（1.5%），用硼酸鹽緩沖液稀釋配成相應(yīng)濃度，采用氯化鈣激活，在40℃下酶促反應(yīng)30 min，以三氯醋酸（5%）沉淀，在257 nm處測定吸收，以確定胰蛋白酶的活力單位[4]。

中性蛋白酶（枯草桿菌蛋白酶10.00 kat）：北京奧博星生物工程公司。其它生物與化學(xué)試劑均為本地化學(xué)試劑公司生物純和分析純，大豆小分子多肽液經(jīng)濃縮→噴霧干燥→大豆小分子肽粉→用去離子水配成透明溶液以備灌胃用。該工藝制成大豆小分子肽采用高效凝膠過濾色譜法（HPGFC）測定：小分子多肽峰值分子量范圍為300 u～700 u之間。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

實(shí)驗(yàn)動物昆明種小白鼠，Wister種大白鼠由本學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。昆明種小白鼠200只，雌雄各半，體重（18±2）g，按性別、體重隨機(jī)分為1個(gè)對照組和3個(gè)試驗(yàn)組。分組后飼養(yǎng)觀察3 d，剔除不合格個(gè)體后灌胃，空白對照組灌胃適量去離子水，各實(shí)驗(yàn)組灌胃大豆小分子肽溶液，劑量分別為每天3、6、9 g/kg。連續(xù)25 d，實(shí)驗(yàn)期間，小鼠自由攝食及飲水[4]。

?。?00±20）g Wister大白鼠 40只，按性別、體重隨機(jī)分為1個(gè)對照組和3個(gè)劑量組。分組后飼養(yǎng)觀察3 d后灌胃，對照組灌胃去離子水5 mL/d，試驗(yàn)組灌胃大豆小分子肽溶液，3個(gè)劑量分別為每天3、6、9 g/kg。飼養(yǎng)50 d，實(shí)驗(yàn)期間，大鼠自由攝食及飲水[5]。Wister種老齡大白鼠。取鼠齡為20個(gè)月，體重為（381.75±39.23）g Wister老齡雄性大白鼠20只，按體重隨機(jī)分為1個(gè)對照組和1個(gè)實(shí)驗(yàn)組。分組后飼養(yǎng)觀察3 d后灌胃，對照組灌胃生理鹽水5 mL/d，試驗(yàn)組灌胃大豆小分子肽溶液6.0 g/kg/d。飼養(yǎng)60 d，實(shí)驗(yàn)期間，大鼠自由攝食及飲水[5]。

1.3 對小鼠游泳時(shí)間的影響

給樣第25 d后，小鼠灌胃0.5 h后，進(jìn)行負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)。小鼠右側(cè)臀負(fù)重6%，放入水溫（25±1）℃、水深40 cm的水槽中游泳，記錄小鼠從入水至運(yùn)動疲勞發(fā)生時(shí)的游泳時(shí)間。小鼠頭部沒入水面以下7 s不再上浮判定為疲勞。記錄疲勞時(shí)間[6]。

1.4 對大白鼠各組SOD活性的影響[7]

大鼠連續(xù)給樣50 d后，分別剪斷股動脈，血用肝素抗凝，取肝臟用冰生理鹽水沖洗，濾紙吸干，精確稱重，加入冰生理鹽水，玻璃勻漿器制成10%的組織勻漿，離心后吸取上清液備用。按微量鄰苯三酚快速測定紅細(xì)胞，肝臟的SOD活性。

1.5 對大白鼠各組SOD；GSH－Px活性和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量的影響[8]

大鼠連續(xù)給樣60 d后，分別剪斷股動脈，血用肝素抗凝，取肝臟用冰生理鹽水沖洗，濾紙吸干，精確稱重，加入冰生理鹽水，玻璃勻漿器制成10%的組織勻漿，離心后吸取上清液備用。按微量鄰苯三酚快速測定紅細(xì)胞，肝臟的SOD活性。而GSH－Px活性和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量測定采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)，用SPSS 10.0 For Windows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，統(tǒng)計(jì)處理數(shù)據(jù)用±s表示。組間比較用t檢驗(yàn)，顯著性水平為（P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 大豆小分子肽對游泳時(shí)間的影響

大豆小分子肽實(shí)驗(yàn)組中高劑量組與對照組（生理鹽水組）相比，力竭游泳時(shí)間明顯延長，差異顯著（P＜0.05）。

表1 大豆小分子肽對游泳時(shí)間的影響Table 1 Effect of soybean minor peptides on mice exhaustive swimming time（±s）

表1 大豆小分子肽對游泳時(shí)間的影響Table 1 Effect of soybean minor peptides on mice exhaustive swimming time（±s）

組別 動物數(shù) 游泳時(shí)間（±s）/min對照組 15 41.7±6.3劑量組3.0 15 40.2±11.9 6.0 15 54.9±10.9*9.0 15 52.4±9.3*

2.2 大豆小分子肽對大白鼠各組SOD活性的影響

大豆小分子肽實(shí)驗(yàn)組中的3個(gè)劑量組與對照組相比，中高劑量組的紅細(xì)胞（Hb）的SOD活性顯著增加（P＜0.05），但兩組沒有劑量相關(guān)性。而肝臟的SOD活性有增加趨勢，但兩組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 大豆小分子肽對的紅細(xì)胞（Hb）肝臟的SOD活性影響nkatal（±s）Table 2 Effect of soybean minor peptides on activities of superoxide dismutase（SOD）of Hb and liver in the mice（±s）

表2 大豆小分子肽對的紅細(xì)胞（Hb）肝臟的SOD活性影響nkatal（±s）Table 2 Effect of soybean minor peptides on activities of superoxide dismutase（SOD）of Hb and liver in the mice（±s）

紅細(xì)胞（Hb） 肝臟（濕重）對照組 10 5.0（水） 248.05±47.34 205.96±72.01劑量組 10 3.0 217.21±32.67 216.54±57.51 10 6.0 353.23±53.18* 232.71±66.19 10 9.0 366.57±85.35* 220.54±52.01組別 動物數(shù) 劑量/（g/kg/d）SOD活性（±s）/（U/mg）

2.3 大豆小分子肽對老年大白鼠SOD活性的影響

大豆小分子肽實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組的紅細(xì)胞（Hb）SOD活性顯著增加（P＜0.05），而肝臟的SOD活性有增加趨勢，但兩組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 大豆小分子肽對老年大白鼠谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－Px）活性的影響

大豆小分子肽實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組的紅細(xì)胞（Hb）GSH－Px活性顯著增加（P＜0.05），而肝臟的

表3 大豆小分子肽對的紅細(xì)胞（Hb）肝臟的SOD活性影響nkatalTable 3 Effect of soybean minor peptides on activities of superoxide dismutase(SOD)of Hb and liver in old rats（±s）

表3 大豆小分子肽對的紅細(xì)胞（Hb）肝臟的SOD活性影響nkatalTable 3 Effect of soybean minor peptides on activities of superoxide dismutase(SOD)of Hb and liver in old rats（±s）

紅細(xì)胞（Hb） 肝臟（濕重）對照組 10 5.0 188.87±35.67 195.21±53.18劑量組 10 3.0 208.65±68.68* 217.04±48.68*組別 動物數(shù) 劑量/（g/kg/d）SOD活性（±S）/（U/mg）

表4 大豆小分子肽對的紅細(xì)胞（Hb）肝臟的GSH-Px活性影響nkatalTable 4 Effect of soybean minor peptides on activities of peroxidase（GSH—Px）of Hb and liver in old rats（±s）

表4 大豆小分子肽對的紅細(xì)胞（Hb）肝臟的GSH-Px活性影響nkatalTable 4 Effect of soybean minor peptides on activities of peroxidase（GSH—Px）of Hb and liver in old rats（±s）

組別 動物數(shù) 劑量/（g/kg/d）GSH－Px活性（±s）紅細(xì)胞（Hb） 肝臟（濕重）對照組 10 5.0 266.38±51.34 310.91±63.51劑量組 10 6.0 215.23±66.51* 329.90±49.01*

GSH－Px活性有增加趨勢，但兩組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 大豆小分子肽對老年大白鼠的血紅細(xì)胞與肝臟組織中丙二醛含量的影響

表5 大豆小分子肽對的紅細(xì)胞（Hb）肝臟的丙二醛含量影響μmol/LTable 5 Effect of soybean minor peptides on the concentration of malondialdehyde（MDA）of Hb and liver in old rats（±s）

表5 大豆小分子肽對的紅細(xì)胞（Hb）肝臟的丙二醛含量影響μmol/LTable 5 Effect of soybean minor peptides on the concentration of malondialdehyde（MDA）of Hb and liver in old rats（±s）

組別 動物數(shù) 劑量/（g/kg/d）MDA 含量（±S）紅細(xì)胞（Hb） 肝臟（濕重）對照組 10 5.0 11.74±3.01 8.79±3.11劑量組 10 9.0 10.97±3.45 9.03±2.65

大豆小分子肽實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組的紅細(xì)胞（Hb）和肝臟中的MDA含量雖有降低的趨勢，但兩組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

疲勞是由運(yùn)動引起機(jī)體一系列生化改變而導(dǎo)致的肌肉力量的降低。評價(jià)疲勞的方法包括耐力試驗(yàn)和生化指標(biāo)的檢測。耐力試驗(yàn)通過測定機(jī)體持續(xù)運(yùn)動至力竭的時(shí)間可以反映機(jī)體的耐力[9]。標(biāo)志疲勞發(fā)生的生化指標(biāo)有以下幾類：（1）能量物質(zhì)，如血糖、肝糖原、肌糖原；（2）代謝調(diào)節(jié)物質(zhì)，如酶、激素；（3）代謝產(chǎn)物，如血和肌肉中的乳酸、血尿素氮、丙酮酸等。只有運(yùn)動時(shí)變化明顯，其變化程度與運(yùn)動負(fù)荷及強(qiáng)度一致的指標(biāo)才能作為疲勞的評價(jià)指標(biāo)。儲存在肌肉中的糖原和葡萄糖，在無氧的條件下分解，終產(chǎn)物是乳酸。乳酸經(jīng)擴(kuò)散進(jìn)入血液，稱為血乳酸。然而在劇烈活動時(shí)，糖酵解供能系統(tǒng)成為供能的主要途徑。導(dǎo)致大量乳酸生成，血乳酸的濃度隨之增加。血液乳酸的含量與運(yùn)動強(qiáng)度關(guān)系密切，血乳酸可作為評定運(yùn)動強(qiáng)度的生化指標(biāo)。糖是主要供能物質(zhì)。隨著負(fù)荷時(shí)間延長，能量供應(yīng)平衡遭到破壞；對糖能量儲備的需要越高，工作肌內(nèi)糖元儲備下降或不足，同時(shí)使蛋白質(zhì)水解酶活性升高，又促進(jìn)蛋白質(zhì)分解代謝加強(qiáng)，合成速度明顯下降，其分解產(chǎn)物氨通過肝和腎轉(zhuǎn)變?yōu)槟蛩?，流?jīng)血液，使血中尿素濃度越來越高，故負(fù)荷越大，持續(xù)時(shí)間越長，血中尿素氮的濃度亦越高。同時(shí)當(dāng)肌肉劇烈運(yùn)動時(shí)，機(jī)體內(nèi)氧化作用大大加強(qiáng)，產(chǎn)生一系列氧自由基可導(dǎo)致肌肉和肝臟中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增多而引起細(xì)胞或組織損傷，也是機(jī)體疲勞的原因之一[10]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：大豆小分子肽（分子量300 u～700 u）的中；高劑量組能明顯延長小鼠負(fù)重游泳時(shí)間，高劑量組具有明顯耐缺氧能力。并且高劑量組小鼠運(yùn)動后血乳酸含量與對照組相比明顯降低。肝糖原；和血尿素氮含量與對照組相比差異不明顯（數(shù)據(jù)未列出），無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而中；高劑量組的大鼠的血紅細(xì)胞的超氧化物歧化酶（SOD）活力明顯高于對照（P＜0.05），而肝臟組織SOD酶活性有升高的趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說明大豆肽具有一定的抗疲勞作用。有關(guān)活性肽的抗疲勞機(jī)制還不清楚，尚需進(jìn)一步的研究。

目前一般認(rèn)為，機(jī)體的衰老與自由基有很大的關(guān)系。機(jī)體在正常代謝過程中可以產(chǎn)生多種活性氧，如超氧陰離子（·O2－），羥自由基（·OH）、過氧化氫 H2O2）等，其中·OH與機(jī)體中的多不飽和脂肪酸（LH）作用，可以產(chǎn)生LPO。LPO的最終代謝產(chǎn)物，如小分子的醛、酮等可以與生物大分子作用，使其失去生理功能，最終導(dǎo)致機(jī)體損傷。生物體內(nèi)的抗氧化物酶，如SOD、GSH－Px可以清除活性氧，對生物體起保護(hù)作用，因此SOD、GSH—Px活性大小，LPO濃度的高低可反映出機(jī)體被氧化損傷的程度[11]。

丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化（脂褐素）LPO代謝物，其含量高低可反映體內(nèi)自由基的反應(yīng)程度，脂質(zhì)過氧化物可引起細(xì)胞代謝及功能障礙甚至死亡，故丙二醛（MDA）的含量?？砷g接反映出機(jī)體受自由基攻擊程度[12]。

實(shí)驗(yàn)表明：大豆小分子肽可明顯增加血紅細(xì)胞（Hb）SOD、GSH—Px活性，而對肝組織中二酶的活性卻不明顯，對MDA含量的抑制作用亦不明顯。

有關(guān)活性肽的抗氧化機(jī)制還不清楚，可能是通過增加SOD，GSH－Px的活性，加快體內(nèi)自由基的清除，從而抑制肝臟內(nèi)過氧化脂質(zhì)的二級分解產(chǎn)物MDA的含量，有利于保護(hù)細(xì)胞免受過氧化損傷，對自由基有關(guān)的疾病有一定的防治作用。但具體是哪種物質(zhì)對抗氧化起主要作用，尚需進(jìn)一步的研究[13]。

本實(shí)驗(yàn)大豆小分子肽只能增加血紅細(xì)胞（Hb）SOD、GSH—Px活性，而對肝組織的活性卻不明顯，并對MDA含量幾乎沒有抑制作用。仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究來解釋。

肽類功能性食品被國內(nèi)外專家稱為21世紀(jì)食品。功能性食品是高附加值產(chǎn)品，關(guān)系到各年齡段人們的健康保健，市場潛力巨大。東北地區(qū)又是大豆的主產(chǎn)區(qū)，大豆小分子肽的開發(fā)可為食品工業(yè)提供了更為優(yōu)質(zhì)的食品輔料，同時(shí)為功能性食品的開發(fā)，提供了強(qiáng)大的物質(zhì)基礎(chǔ)。在實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)和社會效益同時(shí)，又拉動了大豆種植業(yè)，激活了大豆初加工工業(yè)，也會促進(jìn)交通運(yùn)輸、水、電、煤等基礎(chǔ)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

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