建立MN-ZLW系列乳酸菌RAPD指紋圖譜的研究

康小紅，孫國慶，齡南，趙媛，張?zhí)m威，生慶海，*

（1.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司研發(fā)中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 011500；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150001）

我國乳酸菌資源豐富，主要來源于內(nèi)蒙古、新疆、西藏等少數(shù)民族地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，具有悠久的食用歷史。目前，國內(nèi)大部分發(fā)酵乳制品生產(chǎn)企業(yè)均使用國外乳酸菌，但隨著國內(nèi)研究機(jī)構(gòu)、高等院校及企業(yè)對乳酸菌研究的深入和國家相關(guān)規(guī)定的健全，未來本土化乳酸菌會(huì)有巨大應(yīng)用潛力。

乳酸菌為發(fā)酵“起子”其性能會(huì)直接影響產(chǎn)品的質(zhì)量及口感。大量研究證明，不同菌屬乳酸菌和同一菌屬不同菌株特性均有差異[1-2]。中國對于食用乳酸菌有著嚴(yán)格的規(guī)定，如2010年衛(wèi)生部辦公廳關(guān)于印發(fā)《可用于食品的菌種名單》的通知中規(guī)定有21種菌可用于食品，2011年衛(wèi)生部關(guān)于公布可用于嬰幼兒食品的菌種名單的公告中規(guī)定有4種菌株可用于嬰幼兒食品中，此次指明6株菌。因此，準(zhǔn)確鑒定乳酸菌和單一菌株指紋圖譜識(shí)別體系的建立對發(fā)酵乳制品的開發(fā)具有重要意義。乳酸菌常用鑒定方法有16S rDNA基因序列分析，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)（RAPD），脈沖場凝膠電泳（PFGE），擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分析（AFLP）等等。目前，權(quán)威機(jī)構(gòu)常用方法為16 S rDNA基因序列分析方法，其具有高效、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，但成本高、方法復(fù)雜等缺點(diǎn)。其余方法中RAPD方法較為快捷、簡單、經(jīng)濟(jì)、高效等優(yōu)點(diǎn)[3-4]。本文在16 S rDNA基因序列分析基礎(chǔ)上將選擇RAPD技術(shù)建立MN-ZLW系列菌株的指紋圖譜體系，從而為產(chǎn)品生產(chǎn)研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

選擇3株乳酸菌，分別為MN-ZLW-001、MNZLW-002、MN-ZLW-003（來自內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司），具體信息見表1。

表1 樣品信息Table 1 Sample information

1.1.2 藥品

MRS培養(yǎng)基、革蘭氏染色試劑盒：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；RAPD核酸引子 5′-ACGCGCCCT-3′、瓊脂糖凝膠：美國 Invitragen公司，Wizard Genomic DNA提取試劑盒、GoTag Real-Time PCR試劑盒：美國Promega公司；100 bp DNA Maker：美國Thermo公司；無毒熒光染色劑：上海開放生物有限責(zé)任公司；0.5×TBE緩沖溶液，去離子水。

1.1.3 設(shè)備

2 000 237恒溫培養(yǎng)箱：西班牙J.P.SELECTA公司；NIKON E200正立顯微鏡：日本Nikon公司；Z-36HK臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：德國Hermle公司；W20M-2水浴鍋：美國 sheldon manufacturing公司；VORTEXGEMIE2旋渦混合器：美國SCIENTIFIC Instruments公司；2 720 Thermal Cycler PCR儀：美國GENE公司；WP800TL23-K3微波爐：廣東佛山格蘭仕公司；Mupid-One電泳套組：日本ADVANCE公司；BIORAD Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株形態(tài)鑒定方法

將3株乳酸菌粉末分別稀釋10倍，MRS瓊脂培養(yǎng)基劃線，37℃恒溫培養(yǎng)48 h。利用光學(xué)顯微鏡觀察菌落形態(tài)，載玻片固定單一菌落進(jìn)行革蘭氏染色，觀察菌株形態(tài)。

1.2.2 RAPD技術(shù)建立乳酸菌指紋圖譜方法

RAPD技術(shù)建立乳酸菌指紋圖譜方法由提取DNA[5]，PCR擴(kuò)增[6]和電泳成像等3個(gè)步驟組成。DNA提取方法：利用脫脂乳培養(yǎng)基將MN-ZLW-001、MN-ZLW-002、MN-ZLW-003等3株菌分別活化2代，第二代培養(yǎng)菌株劃線于MRS瓊脂培養(yǎng)基，于37℃條件下培養(yǎng)72 h，挑單一菌落接入MRS肉湯，于37℃條件培養(yǎng)18 h，乳酸菌數(shù)約為1×109CFU/mL。取1 mL乳酸菌MRS培養(yǎng)液離心（13 000×g，2 min，4℃），棄上清。依次添加50 mM濃度EDTA溶液480 μL，20 mM溶菌酶溶液 120 μL，并于 37℃ 條件下孵育 1 h，離心（13 000×g，2 min，4 ℃），棄上清；加細(xì)胞核裂解液 600 μL，于 80 ℃條件下孵育5 min，加核糖核酸酶3 μL，于37℃孵育30 min；加的蛋白質(zhì)沉淀溶液200 μL，旋渦混合，離心（13 000×g，3 min，4℃）；將上清移入 1干凈離心管中，加異丙醇 600 μL，離心（13 000×g，2 min，4 ℃），棄上清。加 70%乙醇 600 μL，離心（13 000×g，2 min，4℃），棄上清；空氣干燥沉淀15 min，加DNA溶解液100 μL，于4℃條件放置24 h；利用紫外分光光度計(jì)檢測其濃度。PCR擴(kuò)增：配置25 μL樣品，根據(jù)DNA樣品濃度大小確定添加樣品量，核酸引物添加2.5 μL，GoTagMIX添加 12.5 μL，用無核水進(jìn)行補(bǔ)充至 25 μL；樣品放置于PCR儀器，加熱95℃2 min將雙股DNA變性分離為單股，并循環(huán)30次（95℃ 30 s，27℃ 30 s，72℃30 s），最終以72℃5 min為延長DNA片段。電泳成像：配置1.5%瓊脂糖凝膠100 mL，添加DNA染劑10 μL，制備 10 μL孔的凝膠；TBE緩沖液為電泳介質(zhì)，凝膠孔中加入樣品 1 μL，Marker 2 μL；電泳電壓為100 V，40min；凝膠放入成像系統(tǒng)中進(jìn)行照相；根據(jù)Marker條帶確定試樣條帶分子量。

2 結(jié)果

2.1 MN-ZLW系列乳酸菌菌落形態(tài)及菌株形狀

MN-ZLW-001乳酸菌菌落形態(tài)及菌株形狀，見圖1。

從圖1看出，MN-ZLW-001菌落形態(tài)為圓形、邊緣粗糙、顯黃顏色、凸起、菌落大小中等；菌株形狀為鏈球狀，革蘭氏染色顯陽性。

MN-ZLW-002乳酸菌菌落形態(tài)及菌株形狀，見圖2。

從圖2看出，MN-ZLW-002菌落形態(tài)為圓形、邊緣整齊、顯黃顏色、凸起、菌落偏小；菌株形狀為鏈球狀，革蘭氏染色顯陽性。

MN-ZLW-003乳酸菌菌落形態(tài)及菌株形狀，見圖3。

從圖3看出，MN-ZLW-003菌落形態(tài)為星狀菌落、邊緣粗糙、乳白色、扁平、小菌落；菌株形狀為桿狀，革蘭氏染色顯陽性。

2.2RAPD建立MN-ZLW系列乳酸菌指紋圖譜

MN-ZLW系列乳酸菌DNA電泳圖譜，見圖4。

從圖4看出，MN-ZLW系列乳酸菌DNA組總分子量均大于3 000 bp，還能看出提取DNA中含有少量蛋白。

MN-ZLW系列乳酸菌RAPD指紋圖譜，見圖5。

MN-ZLW系列乳酸菌指紋圖譜分子量，見表2。

從圖5和表2中看出，MN-ZLW-001菌株RAPD指紋圖譜主要條帶有8個(gè)，其中470 bp和900 bp條帶為特性條帶；MN-ZLW-002菌株RAPD指紋圖譜主要條帶有5個(gè)，其中750 bp條帶為特性條帶；MN-ZLW-003菌株RAPD指紋圖譜主要條帶有3個(gè)，其中1000bp條帶為特性條帶。

表2 MN-ZLW系列乳酸菌指紋圖譜分子量Table 2 The LAB MN-ZLW RAPD fingerprints Molecular Weight

3 討論

MN-ZLW系列乳酸菌均來自我國少數(shù)民族地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，如MN-ZLW-001菌株來自新疆維吾爾自治區(qū)塔城市牧民家庭鮮酸奶疙瘩，MN-ZLW-002菌株來自甘肅省甘南縣牧民家庭自制發(fā)酵乳樣品，MN-ZLW-003菌株來自新疆維吾爾自治區(qū)伊犁地區(qū)酸奶塊。根據(jù)16S rDNA鑒定結(jié)果獲知三株菌分別為兩株嗜熱鏈球菌和一株德氏乳桿菌保加利亞種，并保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

本文發(fā)現(xiàn)3株菌均為革蘭氏染色陽性菌，MNZLW-001菌株和MN-ZLW-002菌株為鏈球狀，而MN-ZLW-003菌株為桿狀。根據(jù)菌落形態(tài)發(fā)現(xiàn)MNZLW-001和MN-ZLW-002均為圓形，MN-ZLW-003為星狀，說明MN-ZLW-003不同與MN-ZLW-001和MN-ZLW-002菌，而MN-ZLW-001菌株和MN-ZLW-002菌株的差異不明顯。

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)（RAPD）為利用隨機(jī)引物通過PCR反應(yīng)非特異性擴(kuò)增DNA片段，然后利用凝膠電泳分析擴(kuò)增DNA片段，呈現(xiàn)出一定形式的譜帶，即通過DNA指紋圖譜來完成其進(jìn)化遺傳分析。RAPD技術(shù)常用與細(xì)菌種間、亞種間乃至株間的親緣關(guān)系分析[7-8]。鄭飛云（2007）利用RAPD技術(shù)快速檢出啤酒污染菌[9]；Cagno（2010）利用 RAPD 技術(shù)成功分辨72株植物乳桿菌[10]；崢嶸（2010）利用RAPD技術(shù)分析乳酸菌片球菌、嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌遺傳特性，結(jié)果與傳統(tǒng)方法結(jié)果吻合[11]；2010年，張家超等選用引物M13，選用該方法對乳酸乳球菌亞種和乳酸乳球菌乳脂亞種進(jìn)行區(qū)分[12]。目前，RAPD技術(shù)在乳酸菌鑒定領(lǐng)域中的應(yīng)用已中逐漸增多，使用程度也日漸成熟。

本文利用RAPD技術(shù)建立MN-ZLW系列乳酸菌指紋圖譜發(fā)現(xiàn)，MN-ZLW-001菌株有8個(gè)條帶，MNZLW-002菌株有5個(gè)條帶，MN-ZLW-003菌株只有3個(gè)條帶，而且還發(fā)現(xiàn)每株菌濃度較高條帶也不同，依次為 470 bp、900 bp，750 bp和 1 000 bp，說明 RAPD 技術(shù)建立的指紋圖譜能有效分辨出菌株間差異。

4 結(jié)論

從形態(tài)學(xué)角度能分辨不同菌屬，但無法分辨同屬不同菌株。RAPD技術(shù)有快速、簡單、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，有效分辨菌株間差異。本文利用RAPD技術(shù)成功建立MNZLW系列乳酸菌指紋圖譜，這對于MN-ZLW系列菌株的知識(shí)產(chǎn)權(quán)的保護(hù)及生產(chǎn)加工具有重要意義。

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