生長(zhǎng)抑素在老年鼠胃竇黏膜和血漿中的表達(dá)

王玉蘭 鐵振軍 張?zhí)┎?/p>

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室北京市老年病醫(yī)療研究中心，北京100053)

生長(zhǎng)抑素(somatostatin，SS)參與調(diào)節(jié)胃酸分泌的生理功能引起各國(guó)消化界學(xué)者的普遍關(guān)注。為了探討生長(zhǎng)抑素在老年與胃酸分泌的關(guān)系，本文采用放射免疫法對(duì)老年Wistar大鼠胃黏膜組織、血漿中SS含量進(jìn)行測(cè)定，對(duì)胃黏膜組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，研究老年期生長(zhǎng)抑素對(duì)胃酸分泌的影響及生長(zhǎng)抑素在胃內(nèi)分布情況，探討老化過(guò)程中SS作為一種胃酸抑制因素存在的重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇不同年齡Wistar大鼠。由首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院動(dòng)物室培育，雌雄隨機(jī)抽樣。青年鼠(3月齡)組20只，體質(zhì)量200 g～250 g，老年鼠(24～30月齡)15只，體質(zhì)量400 g～450 g。動(dòng)物許可證號(hào):Wistar SCXK(京)2002-2003?？贵w及試劑盒由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 方法

1)免疫組織化學(xué)染色:分別取2組Wistar大鼠各12例胃竇新鮮組織標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋，切成6 μm厚連續(xù)切片，采用免疫組織化學(xué)SP法染色。

染色步驟如下:石蠟切片脫蠟和水化后，分別滴加1∶50的兔SS-14抗血清，4℃孵育過(guò)夜。第二天滴加1∶100羊抗兔IgG，37℃孵育10 min，滴加1∶100辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素IgG，37℃孵育10 min，PBS沖洗。DAB顯色液顯色7 min，蘇木素復(fù)染，加拿大膠封片。PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。陽(yáng)性顯色分級(jí)根據(jù)Michio記分法［1］判斷。

結(jié)果判斷:陽(yáng)性細(xì)胞著染標(biāo)準(zhǔn)為棕褐色，并將其集中于黏膜中帶區(qū)域測(cè)算細(xì)胞數(shù)量。(-)無(wú)染色細(xì)胞=0，著染細(xì)胞 ＜1/3=1，著染細(xì)胞 ＜2/3=2，大量著染細(xì)胞=3，按染色程度，輕度著染=1，染色較強(qiáng)=2。將所測(cè)的細(xì)胞計(jì)分與染色計(jì)分相加，所得數(shù)值按0=(-)，2=( ± )，3=(+)，4=(++)，5=(+++)，歸類取得判斷結(jié)果。

2)放射免疫測(cè)定:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按規(guī)定月齡取血，加入含有10%EDTA和500 KIU胰肽酶的試管內(nèi)，分離血漿，丙酮提取，吹干保存待測(cè)。然后處死動(dòng)物，取胃竇新鮮組織，加0.1 mmol HCL，沸水浴10 min，16 000 r/min離心20 min，提取上清液，分裝，-80℃冰箱保存待測(cè)。標(biāo)本測(cè)定前用NaOH調(diào)成中性，采用Lowry法測(cè)定組織蛋白含量。生長(zhǎng)抑素測(cè)定采用放射免疫分析法。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，2組間均數(shù)的比較用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用例數(shù)表示，采用秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

老年鼠胃黏膜組織染色與青年鼠相比D細(xì)胞陽(yáng)性顯色數(shù)量明顯增多，為強(qiáng)陽(yáng)性+++和陽(yáng)性++，細(xì)胞形狀大而不規(guī)則，其少量分布于胃黏膜腺體間，大量集中于胃黏膜腺體底部，著色較深，D細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)布滿SS免疫復(fù)合物顆粒。而青年鼠D細(xì)胞著染數(shù)量較少，主要是+，分布于胃黏膜腺體底部。陰性對(duì)照未見(jiàn)免疫陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)。2組之間Mam-whitney檢驗(yàn)(Z=-4.378，P=0.000 1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見(jiàn)表1。

表1 SS在青、老年Wistar大鼠胃竇組織上的表達(dá)Tab.1 The expression of SS in gastric mucosa in young and older rat

2.2 動(dòng)物胃黏膜、血漿生長(zhǎng)抑素

老年鼠(24～30月齡)胃黏膜組織SS濃度高于青年鼠(3月齡)，2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。血漿SS測(cè)定2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，詳見(jiàn)表2。

表2 2組Wistar大鼠胃黏膜組織、血漿中SS比較Tab.2 Two groups of Wistar rat gastric mucosal tissue，plasma SS comparison(±s)

表2 2組Wistar大鼠胃黏膜組織、血漿中SS比較Tab.2 Two groups of Wistar rat gastric mucosal tissue，plasma SS comparison(±s)

＊＊ P＜0.01 vs young rats group;SS:somatostatin.

Group Number Gastric mucous membrane/(pg·mL-1)Plasma/(pg·mL-1)Young rats 20 150.1±92.1 26.8±8.6 Elderly rats 15 362.5 ±182.5＊＊33.5±11.2

3 討論

關(guān)于SS抑制胃酸分泌生理功能與疾病的關(guān)系，研究［2-3］表明胃的SS大部分局限于胃體、胃竇、幽門(mén)部黏膜內(nèi)的D細(xì)胞，這些D細(xì)胞通過(guò)其伸長(zhǎng)的細(xì)胞突與胃體的壁細(xì)胞、主細(xì)胞和幽門(mén)的G細(xì)胞直接接觸，通過(guò)旁分泌途徑抑制胃酸分泌，所以SS也是一種具有代表性的旁分泌激素。生長(zhǎng)抑素抑制胃酸分泌的主要機(jī)制是:①通過(guò)抑制胃竇G細(xì)胞分泌胃泌素，從而抑制胃酸分泌;② 通過(guò)胃體部壁細(xì)胞上生長(zhǎng)抑素受體介導(dǎo)，直接抑制壁細(xì)胞的胃酸分泌;③ 通過(guò)胃體部主細(xì)胞抑制受體介導(dǎo)，抑制主細(xì)胞分泌胃蛋白酶原［4］。老年大鼠胰腺生長(zhǎng)抑素及胰島素釋放實(shí)驗(yàn)［5］顯示24～30月齡大鼠在接受氨基酸、葡萄糖溶液刺激后釋放量增高，高于2～18月齡大鼠，表明進(jìn)入老年期大鼠胰腺SS抑制作用增強(qiáng)。SS能有效抑制胃蛋白酶、胰高血糖素的釋放，有利于抑制胃酸分泌，胃腸道黏膜循環(huán)的改善及黏膜修復(fù)［6-7］。本課題組對(duì)2組大鼠的胃竇黏膜組織和血漿進(jìn)行了SS觀察測(cè)定，發(fā)現(xiàn)SS在不同年齡組大鼠胃黏膜內(nèi)具有不同的生理作用濃度，尤其在老年鼠呈高濃度分泌，與青年鼠有非常顯著的差異。SS可通過(guò)抑制胃蛋白調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶活性而對(duì)胃酸分泌有很強(qiáng)的抑制作用，它可通過(guò)抑制胃竇G細(xì)胞釋放胃泌素，抑制腸嗜鉻細(xì)胞釋放組胺以及直接抑制壁細(xì)胞的功能抑制胃酸分泌［8］。對(duì)青年和老年人進(jìn)行胃酸分泌實(shí)驗(yàn)結(jié)果［9-10］顯示，小劑量五肽胃泌素刺激后兩組胃酸排出量均不同程度增加，同時(shí)出現(xiàn)胃液SS升高，表明胃酸刺激SS釋放，提示SS是胃酸調(diào)節(jié)的重要因素。實(shí)驗(yàn)也表明老年人胃酸排出量明顯低于青年人，證明老年人泌酸功能減低伴隨生長(zhǎng)抑素水平升高。在小劑量五肽胃泌素刺激后胃液SS仍持續(xù)出現(xiàn)高分泌狀態(tài)，提示老年人低胃酸狀態(tài)與高生長(zhǎng)抑素濃度有關(guān)。巫協(xié)寧等［11］，認(rèn)為老年人泌酸功能低主要是年齡因素，而不是老年人萎縮性胃炎發(fā)病增高所致。關(guān)于SS在胃內(nèi)的分布，Kusumoto等［2］已論述D細(xì)胞與分泌生長(zhǎng)抑素關(guān)系。本研究表明，Wistar老年鼠胃竇黏膜腺窩與腺體交接處分布大量著染D細(xì)胞，胞漿內(nèi)布滿SS免疫復(fù)合物顆粒，形狀不規(guī)則，著色較深，其數(shù)量和著染程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)青年鼠。這一研究結(jié)果表明，老年泌酸功能與老年期胃黏膜D細(xì)胞數(shù)量增加、生長(zhǎng)抑素分泌量增高與其抑酸調(diào)節(jié)作用存在重要關(guān)系。SS抑酸調(diào)節(jié)作用是通過(guò)旁分泌途徑抑制胃泌素分泌［12-13］，也可作為循環(huán)激素以內(nèi)分泌途徑抑制胃酸分泌。本研究測(cè)定血漿SS濃度，結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明SS作用以旁分泌途徑表達(dá)為主，而且因SS本身還具有其他生理作用，所以尚需進(jìn)一步探討。在老化過(guò)程中，消化功能減退，生長(zhǎng)抑素可能起到重要調(diào)節(jié)作用，因此對(duì)SS與機(jī)體衰老的關(guān)系應(yīng)進(jìn)行更加廣泛深入的研究。

［1］Shiminu M，Saitoh Y，Itoh H.Immunohistochemical staining of Ha-rat oncogene product in normal，benign and malignant human pancreatic tissues［J］.Hum Pathol，1990，21(6):607-612.

［2］Kusumoto Y，Iwanaga T，Ito S，et al.Juxtaposition of somatostain cell and parietal cell in the dogstomach［J］.Arch Histrol Jpn，1979，42(4):459-465.

［3］Park J，Chiba T，Yamada T.Mechanisms for muscarinic for idrect inhibition of canine gastric parietal cell by smoatostatin［J］.J Biol Chem，1987，262(29):14190-14196.

［4］章振生，王承黨.生長(zhǎng)抑素類似物奧曲肽對(duì)老年人消化性潰瘍并上消化道大出血的療效觀察［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2011，7(9):69-71.

［5］Starnes J W，Cheong E，Matschinsky F M，et al.Hormone secretion by isolated perfused pancreas of aging Fischer 344 rats［J］.Am J Physiol，1991(1 Pt 1)，260:E59-E66.

［6］李志，李雪峰，張穎.生長(zhǎng)抑素對(duì)老年消化性潰瘍出血病人血流動(dòng)力學(xué)改變的影響［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2010，30(11):1571-1572.

［7］王玉文，呂美娜，康富標(biāo).上消化道出血患者持續(xù)泵入生長(zhǎng)抑素引起低血糖昏迷［J］.臨床誤診誤治，2011，24(5):97

［8］周德生，朱婷，胡華，等.生長(zhǎng)抑素、胃泌素與應(yīng)激性潰瘍的中醫(yī)藥干預(yù)研究進(jìn)展［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2010，8(5):597-600.

［9］鐵振軍，張?zhí)┎?，王玉蘭，等.老年胃酸分泌與生長(zhǎng)抑素的研究［J］.新消化病學(xué)雜志，1997，5(4):235-236.

［10］鐵振軍，張?zhí)┎?，王玉蘭，等.老年鼠胃竇黏膜與血漿生長(zhǎng)抑素的研究［J］.北京醫(yī)學(xué)，2005，27(3):159-161.

［11］巫協(xié)寧，陳仕蕘，張德忠，等.老年與中、青年胃潰瘍患者泌酸功能的比較［J］.中華消化雜志，1982，2(3):169-170.

［12］Wu L C，Cao Y F，Huang H J，et al.High dose vs.Lowdose proton pump inhibitors for upper gastrointestimal bleeding:a meta-analysis［J］.World J Gastroenterol，2010，16(20):2558-2565.

［13］吳波，杜強(qiáng)，鄭長(zhǎng)青，等.胃泌素和生長(zhǎng)抑素在糖尿病胃輕癱事作用的研究［J］.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，38(10):783-785.