阻塞性黃疸大鼠肝臟中法尼酯衍生物X受體的表達及CDCA對其影響

黃偉煒，鄭進方，宮曉光，王保春，伍海鷹，劉寧

（海南省人民醫(yī)院普通外科，海南海口570311）

阻塞性黃疸大鼠肝臟中法尼酯衍生物X受體的表達及CDCA對其影響

黃偉煒，鄭進方，宮曉光*，王保春，伍海鷹，劉寧

（海南省人民醫(yī)院普通外科，海南?？?70311）

目的探討應(yīng)用鵝脫氧膽酸（CDCA）治療膽汁淤積性疾病的可行性。方法取4周齡健康雄性SD大鼠72只，隨機將其中48只大鼠的膽總管在十二指腸上方雙重結(jié)扎后剪斷然后縫合關(guān)腹，建立膽道阻塞大鼠動物模型。另外24只大鼠僅游離膽總管但并不結(jié)扎，然后縫合關(guān)腹作為對照組。觀察大鼠膽管阻塞1 d、3 d、7 d和14 d四個時段的肝臟組織形態(tài)學改變，并檢測這四個不同時段的大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、總膽紅素（TB）和總膽汁酸（TBA）等血液生化指標；通過免疫組化方法觀察大鼠膽管阻塞不同時段的法尼酯衍生物X受體（FXR）表達變化，同時利用上述方法研究CDCA在大鼠膽管阻塞進程中的作用。結(jié)果大鼠膽管阻塞后，肝內(nèi)膽管擴張，纖維組織增生，但14 d后癥狀有所緩解；隨大鼠膽管阻塞時間延長，血清中ALT、TB和TBA明顯升高。第7天達到峰值，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，第14天時均明顯下降；CDCA可不同程度的降低大鼠血清中ALT、TB和TBA的水平。另外，隨大鼠膽管阻塞時間的延長，F(xiàn)XR表達上調(diào)，第7天最為明顯。CDCA治療可明顯減輕大鼠膽管阻塞后所致的肝臟損傷，CDCA可抑制FXR的表達上調(diào)。結(jié)論膽管阻塞可導(dǎo)致肝損傷和肝纖維化，其程度和血清中的ALT水平呈密切相關(guān)。膽道阻塞時，膽汁酸濃度的上升刺激FXR表達上調(diào)，并隨阻塞時間延長，F(xiàn)XR蛋白表達增高相對緩慢。FXR的激動劑——CDCA可減輕膽道阻塞后大鼠肝臟損害。

法尼酯衍生物X受體；阻塞性黃疸；鵝脫氧膽酸；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；總膽紅素；總膽汁酸

法尼酯衍生物X受體（Farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）是重要的孤兒核受體之一，其主要在大鼠肝臟中表達。研究發(fā)現(xiàn)，生理水平的膽汁酸是FXR的內(nèi)源性配體，提示FXR對膽汁酸和膽固醇穩(wěn)態(tài)有重要的調(diào)節(jié)作用[1-2]，因此，F(xiàn)XR也被稱為膽汁酸受體（Bile acid receptor，BAR），又稱為膽汁酸感受器。它可通過調(diào)控一系列基因表達參與機體包括膽汁酸代謝，改善和治療與膽汁酸代謝相關(guān)疾病。

在正常生理狀態(tài)下，F(xiàn)XR可通過與靶基因啟動子上的FXR反應(yīng)元件的結(jié)合，使一系列參與調(diào)節(jié)膽汁酸和膽固醇代謝的基因發(fā)生表達變化，從而影響機體的膽汁酸和膽固醇代謝[3-4]。FXR的激動劑可通過干預(yù)膽汁酸的合成、轉(zhuǎn)運和吸收治療膽汁淤積性肝病。FXR有效的內(nèi)源性配體有鵝脫氧膽酸（Chenodeoxycholic acid，CDCA）、石膽酸（Lithocholic acid，LCA）、脫氧膽酸（Desoxycholic acid，DCA）和膽酸（Cholic acid，CA），其中以CDCA的激活作用最明顯[5]。

阻塞性黃疸（簡稱“阻黃”）是由肝內(nèi)、外膽管的機械性損傷使膽汁酸在肝內(nèi)淤積所導(dǎo)致的全身多系統(tǒng)臨床病癥。阻黃時，血清中膽汁酸含量升高，刺激FXR表達上調(diào)。因此，研究膽道阻塞后大鼠肝臟中的FXR基因表達，搞清楚膽道阻塞過程與FXR表達的變化，對阻塞性黃疸的臨床治療具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SD大鼠（SD）由吉林大學白求恩醫(yī)學院動物中心提供，合格證號：吉實動質(zhì)(2000) 042號。實驗前在室內(nèi)標準鼠糧常規(guī)飼養(yǎng)，實驗符合國家關(guān)于實驗動物倫理保護標準。

1.2 實驗方法

1.2.1 膽道阻塞大鼠動物模型的建立參照林木生等[6]文獻方法，取4周齡健康雄性SD大鼠72只，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，禁食不禁水12 h。然后用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（2 ml/kg），并在無菌條件下取上腹部正中切口開腹，其中隨機將其中48只大鼠的膽總管在十二指腸上方雙重結(jié)扎后剪斷然后縫合關(guān)腹，建立膽道阻塞大鼠動物模型。另外24只大鼠僅游離膽總管但并不結(jié)扎，然后縫合關(guān)腹作為對照組（Control group，CG）。所有大鼠術(shù)后自由進食進水。

1.2.2 實驗分組將模型大鼠隨機分為三組，每組24只。第一組常規(guī)喂養(yǎng)作為對照組（CG組）;第二組為膽道梗阻組（BDL組）；第三組按20 mg/kg灌胃給予鵝去氧膽酸(CDCA組)，1次/d。然后將BDL組、CDCA組和CG組各再隨機分1 d、3 d、7 d和14 d四個時段，每個時段6只大鼠，各組分籠飼養(yǎng)。

1.3 實驗監(jiān)測

1.3.1 大鼠血液生化指標檢測三組大鼠分別于術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d下腔靜脈穿刺抽血3～4 ml，檢測時采用全自動血生化分析儀檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、總膽紅素（TB）和總膽汁酸（TBA）。

1.3.2 大鼠肝臟組織病理檢測三組大鼠分別于術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d切取肝組織，常規(guī)石蠟包埋，伊紅-蘇木素染色，光鏡下觀察肝臟顯微結(jié)構(gòu)變化。

1.3.3 大鼠肝臟組織的FXR免疫組化檢測取5 μm厚石蠟切片，經(jīng)脫蠟、水化、微波抗原修復(fù)后，滴加100 μl 3%過氧化氫孵育5～10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。每張切片滴加一抗，4℃孵育過夜后滴加二抗，37℃孵育10～15 min。切片滴加2滴新鮮配置的DAB溶液，室溫避光顯色3～5 min，沖洗。然后用蘇木素輕度復(fù)染5 min，梯度酒精脫水、干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片。結(jié)果判斷標準為：在細胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒或斑片為陽性細胞，每張切片取5個高倍視野不少于250個細胞，陽性細胞數(shù)大于＜10%為-，10%～25%為+，25%～50%為++，50%～75%為+++。

2 結(jié)果

2.1 大鼠形態(tài)觀察對照組大鼠毛發(fā)有光澤，體態(tài)活潑，食量及二便正常。膽總管結(jié)扎組大鼠2～3 d后出現(xiàn)小便發(fā)黃，糞便變白；術(shù)后7 d出現(xiàn)毛發(fā)和尾部黃染、耳黃等明顯黃疽表現(xiàn)；解剖發(fā)現(xiàn)，膽總管明顯擴張，肝臟腫大，有黃染現(xiàn)象；第14天肝臟出現(xiàn)壞死病灶。

2.2 大鼠肝臟組織病理變化光鏡下，經(jīng)HE染色后，對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞索排列整齊，呈放射狀，肝竇正常，胞核結(jié)構(gòu)清晰。膽總管結(jié)扎組1 d即可見匯管區(qū)結(jié)締組織和膽管增生，并向肝小葉內(nèi)擴展,有瘀膽現(xiàn)象；結(jié)扎3 d可見肝內(nèi)膽管擴張，匯管區(qū)纖維增生；結(jié)扎7 d肝細胞部分變性，結(jié)締組織大量增生，纖維組織大量增生變寬，膽小管擴張明顯，出現(xiàn)少量的肝細胞壞死灶；結(jié)扎14 d，匯管區(qū)面積擴大，周圍肝細胞變性，可見成片的肝細胞結(jié)構(gòu)改變，并出現(xiàn)大面積壞死（見圖1）。給予CDCA后，第1天可見匯管區(qū)結(jié)締組織和膽管增生并不明顯，有少量瘀膽現(xiàn)象；3～7 d時，匯管區(qū)有少量纖維增生，但與結(jié)扎組相比明顯減輕；14 d時，僅出現(xiàn)少量壞死灶（見圖2）。在膽道阻塞組和鵝去氧膽酸組大鼠隨著膽管阻塞時間的延長，大鼠肝臟組織病理切片顯示肝纖維化程度逐漸加重；但鵝去氧膽酸組肝纖維化程度相比同一時相膽道阻塞組明顯減輕。

圖1 BDL組7 d時肝臟的病理變化(HE×200)圖2CDCA組7 d時肝臟的病理變化（HE×200)

2.3 大鼠血液生化指標檢測

2.3.1 不同時相大鼠血清ALT變化比較結(jié)果表明，CG組不同時相大鼠血清ALT變化不明顯。BDL組1 d、3 d和7 d的大鼠血清ALT變化隨時間延長明顯升高，以第7天為最高，與CG組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；14 d的大鼠血清ALT變化降低，與CG組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與BDL組相比較，CDCA組不同時相大鼠血清ALT升高不太明顯，與BDL組比較大鼠血清ALT變化第1天差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；第3天和第7天差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；第14天差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表1。

表1 不同時相大鼠血清ALT變化比較（，μmol/L)

表1 不同時相大鼠血清ALT變化比較（，μmol/L)

注：與CG組比較，*P＜0.01，**P＜0.05；與BDL組比較，#P＜0.01，##P＜0.05。

組別CG組BDL組CDCA組只數(shù)6 6 6 1 d 33.33±17.07 858.55±299.02*745.32±177.10 3 d 30.83±14.57 928.57±349.24*839.94±48.40##7 d 31.17±21.54 1031.58±354.08*934.54±22.81##14 d 33.67±15.95 986.17±34.22**873.17±31.15#

2.3.2 不同時相大鼠血清TB變化比較結(jié)果表明，CG組不同時相大鼠血清TB變化不明顯。BDL組1 d、3 d和7 d的大鼠血清TB變化隨時間延長明顯升高，以第7天最高，與CG組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；14 d的大鼠血清TB變化降低，與CG組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。CDCA組不同時相大鼠血清TB變化與BDL組相比升高不太明顯；與BDL組比較大鼠血清TB變化第1天、第3天、第7天差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表2。

2.3.3 不同時相大鼠血清TBA變化比較結(jié)果表明，CG組不同時相大鼠血清TBA變化不明顯。BDL組1 d、3 d和7 d的大鼠血清TBA變化隨時間延長明顯升高，以第7天最高，與CG組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；14 d的大鼠血清TBA變化降低，但與CG組比較差異仍有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。CDCA組不同時相大鼠血清TBA變化與BDL組相比升高不太明顯；與BDL組比較大鼠血清TBA變化第1天和第3天差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；第7天差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；第14天差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表3。

表2 不同時相大鼠血清TB變化比較(，μmol/L)

表2 不同時相大鼠血清TB變化比較(，μmol/L)

注：與CG組比較，*P＜0.01，**P＜0.05；與BDL組比較，#P＜0.01，##P＜0.05。

組別CG組BDL組CDCA組14 d 14.68±3.48 135.87±6.53**112.65±33.06只數(shù)6 6 6 1 d 15.33±3.47 106.67±59.46*79.42±12.54##3 d 14.33±4.67 133.58±17.69*100.55±45.12##7 d 14.68±2.07 147.13±22.59*107.33±57.48##

表3 不同時相大鼠血清TBA變化比較（，mmol/L)

表3 不同時相大鼠血清TBA變化比較（，mmol/L)

注：與CG組比較，*P＜0.01,**P＜0.05；與BDL組比較，#P＜0.01，##P＜0.05。

組別CG組BDL組CDCA組14 d 10.13±1.76 253.85±20.06*156.05±22.02##只數(shù)6 6 6 1 d 8.9±1.04 92.33±42.89*63.55±8.12##3 d 9.45±1.61 184.68±37.67*124.61±32.41##7 d 10.5±2.92 277.58±35.87*154.35±5.52#

2.4 大鼠肝臟組織的FXR表達變化FXR蛋白染色陽性產(chǎn)物分布于細胞漿內(nèi)。CG組大鼠肝細胞FXR蛋白呈輕度表達。隨著膽總管結(jié)扎時間延長，BDL組第1天、第3天、第7天的大鼠肝細胞FXR蛋白表達逐漸升高，以第7天為最高，與CG組比較，第1天差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；第3天差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；第7天差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；第14天肝細胞FXR蛋白表達增高相對緩慢，與CG組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與BDL組比較CDCA組肝細胞FXR蛋白表達增高相對緩慢，7 d后最明顯，與BDL組比較，第7天差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；第1、3、14天差異無統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表4和圖3、圖4。

表4 每組每時間點血清FXR的表達

圖3 BDL組第7天FXR的表達(IHC×400)圖4CDCA組第7天FXR的表達(IHC×400)

3 討論

阻黃時，由于正常膽汁酸肝腸循環(huán)受阻，腸道內(nèi)膽鹽缺乏，細菌過度繁殖，內(nèi)毒素增加，釋放大量細胞因子，介導(dǎo)了肝細胞的損傷反應(yīng)[7]。另外，積聚在血清和肝臟內(nèi)具有細胞毒性的游離膽汁酸，還可攻擊肝細胞的生物膜，加重細胞損傷。由于FXR為膽汁酸受體，其活化可調(diào)節(jié)機體的膽汁酸代謝，維持膽汁酸的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，而CDCA是FXR有效的內(nèi)源性配體，因此CDCA與FXR的作用可激活FXR，降低膽汁酸濃度，減少膽汁池的疏水性與毒性，從而減輕肝細胞和肝臟損傷程度與范圍，穩(wěn)定肝細胞膜，保護肝臟[8]。本研究結(jié)果證明，大鼠膽總管結(jié)扎后，肝臟的損傷隨著阻塞時間延長而加重；當給予CDCA時，大鼠肝損傷程度明顯減輕。這與上述理論完全吻合，表明FXR的激動劑——CDCA能減輕膽道阻塞后大鼠肝臟的損傷。

當膽管阻塞時，由于整個膽道系統(tǒng)內(nèi)的膽汁淤積，導(dǎo)致膽紅素和膽汁酸等的排泄不暢，并通過受損肝細胞進入血液，形成高膽紅素和高膽汁酸血癥[9]。另外，當膽道梗阻時，隨膽管內(nèi)壓力上升，門靜脈受壓，肝血流量減少，使肝臟結(jié)構(gòu)破壞和改建，肝功能發(fā)生嚴重障礙；而由于膽管上皮增生[10]，造成微循環(huán)通路紊亂，增加微循環(huán)阻力，從而使血清ALT逐漸上升。本實驗結(jié)果表明，隨著膽管阻塞時間的延長，血清ALT、TB和TBA水平在膽管結(jié)扎后數(shù)小時即升高，并在第7天達到高峰，然后其數(shù)值驟然下降，但仍高于對照組。這說明大鼠肝功能隨膽管阻塞發(fā)生了障礙，導(dǎo)致肝功能指標上升，這與上述理論相符。而第14天驟然下降，可以認為這主要是由于隨膽管阻塞時間延長，肝臟嚴重損害，肝細胞合成和分泌膽汁酸能力下降，返流入血的量相應(yīng)減少所致。而腎臟代償作用增強，加快膽紅素的排出也是使TB下降最快的一個原因[11]。Liu等[12]曾分析大鼠血膽紅素下降是由于肝細胞功能嚴重受損，膽紅素返流入血減少所致；而Li等[13]報道了在離體大鼠肝細胞中，過高水平的膽紅素和膽汁酸可使自身的葡醛酸化加速，結(jié)合產(chǎn)物的水溶性增加，易于從尿中排泄。

本研究發(fā)現(xiàn)，在膽道阻塞組和鵝去氧膽酸組大鼠隨著膽管阻塞時間的延長，血清ALT水平逐漸升高，同時大鼠肝臟組織病理切片顯示肝纖維化程度逐漸加重。但鵝去氧膽酸組肝纖維化程度相比同一時相膽道阻塞組明顯減輕。大鼠膽管阻塞后給予CDCA，血清ALT、TB和TBA水平隨時間延長增高相對緩慢，與阻塞組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01或P＜0.05），其中ALT和TBA在3 d、7 d時最為明顯，表明CDCA具有明顯改善肝功能，修復(fù)膽固醇代謝和防止毛細膽管破裂的作用。給予CDCA后，血清TBA水平雖然與阻塞組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但并不隨時間延長而下降，表明CDCA對TBA代謝沒有時間的依賴性。以上結(jié)果充分證明，血清中的ALT水平與肝纖維化程度呈密切相關(guān)，CDCA對改善肝功能，修復(fù)膽汁酸代謝有重要作用。

FXR不僅可與膽汁酸直接結(jié)合，而且還可通過與靶基因啟動子上的FXR反應(yīng)元件（FXRE）的結(jié)合，調(diào)節(jié)膽汁酸代謝和膽固醇逆轉(zhuǎn)運基因的表達，因此FXR的激動劑可通過干預(yù)膽汁酸的合成、轉(zhuǎn)運和吸收，改善和治療與膽汁酸代謝相關(guān)疾病[14]。CDCA是FXR最有效的配體，當發(fā)生膽管阻塞時給予CDCA，可促使在肝淤膽病變中起決定作用的膽鹽輸出蛋白表達，從而促進膽管內(nèi)膽汁酸排泄，防止肝細胞內(nèi)膽汁酸的過度堆積[11]。本實驗結(jié)果顯示，F(xiàn)XR蛋白在細胞漿內(nèi)呈陽性表達；當膽管結(jié)扎時，隨時間的延長FXR蛋白表達逐漸升高，7 d時表達較高，14 d后FXR蛋白表達增高相對緩慢。與BDL組比較CDCA組肝細胞FXR蛋白表達增高相對緩慢，7 d最明顯。這是由于隨著阻塞時間的延長，肝臟中膽汁酸濃度上升，刺激了FXR的表達上調(diào)，以代償性減少肝臟受膽汁酸的毒性侵害。但隨著阻塞時間的進一步延長，肝臟嚴重損害，肝細胞合成和分泌膽汁酸能力下降，從而抑制了FXR的表達上調(diào)。另外，大鼠強烈的肝再生功能，也可抑制FXR的表達上調(diào)。FXR能通過感受內(nèi)源性代謝因子的水平來感受肝臟容積，以促進肝再生，適應(yīng)肝臟的重負荷[15]。對于CDCA的作用，可以認為由于CDCA是初級膽汁酸，它的存在抑制了肝細胞膽汁酸的分泌與合成，使肝臟膽汁酸濃度降低，F(xiàn)XR表達降低。

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Expression of farnesoid X receptor in the liver of rats with obstructive jaundice and the effect of CDCA.

HUANG Wei-wei,ZHENG Jin-fang,GONG Xiao-guang*,WANG Bao-chun,WU Hai-ying,LIU Ning.Department of General Surgery,People's Hospital of Hainan Province,Haikou 570311,Hainan CHINA

ObjectiveTo evaluate the effect of chenodeoxycholic acid(CDCA)in the treatment of hepatobiliary disease,and to prove a new targets of FXR as treatment drug for obstructive jaundice.MethodsSeventy-two 4-weeks-old male Sprague-Dawley(SD)rats were enrolled in this study.Forty-eight of the rats had the common bile duct ligated above the duodenum,and then cut and sutured to establish the rat model of bile duct obstruction(the study group).The other 24 rats had the common bile duct separated and then sutured(the control group).The morphological changes of liver tissue 1 d,3 d,7 d,and 14 d after bile duct obstruction were observed.The alanine aminotransferase(ALT),total bilirubin(TB)and total bile acid(TBA)in serum were detected.The expression of FXR in different stage of bile duct obstruction was observed by immunohistochemistry.At the same time,the role of CDCA played in the process of rat bile duct obstruction was investigated.ResultsAfter bile duct obstruction,the rats suffered intrahepatic cholangiectasis,fibroustissue hyperplasia,which relieved 14 d later.The levels of ALT,TB and TBA in serum were significantly increased as the increase of time after obstruction,reaching the peak on the 7thday after obstruction (P＜0.05).The levels were decreased significantly on the 14thday after obstruction.CDCA could reduce the level of ALT,TB and TBA in serum to varying degrees.In addition,with the extension of time after obstruction,the expression of FXR was up-regulated reached the peak on the 7thday,which indicates that CDCA could inhibit the expression of FXR obviously.ConclusionBile duct obstruction can lead to liver injury and fibroustissue hyperplasia,the degree of which is positively correlated between the level of ALT in serum.Bile duct obstruction leads to the increase of bile acid concentration,which stimulates the expression of FXR.FXR agonist(CDCA)can relieve the liver damage after biliary obstruction.

Farnesoid X receptor;Obstructive jaundice;Chenodeoxycholic acid;Alanine aminotransferase; Total bilirubin;Total bile acid

R-332

A

1003—6350（2012）22—020—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.22.007

2012-10-12)

黃偉煒（1970—），男，海南省海口市人，副主任醫(yī)師，碩士，研究方向為肝膽胰脾胃腸疾病。E-mail：iewhuangiew@126.com

*通訊作者：宮曉光，博士。E-mail：gxg6868@yahoo.com.cn