小腸結節(jié)灌注與尤斯灌流技術在豬腸道功能研究方面的應用

唐宇龍 ，何流琴 ，2，C.M.NYACHOTI，印遇龍

（1．中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所，中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術中心，農業(yè)部中南動物營養(yǎng)與飼料科學觀測實驗站，湖南長沙，410125；2.中國科學院研究生院，北京100039；3.Department of Animal Science,University of Manitoba,Winnipeg,Manitoba,Canada.R3T 2N2）

生豬健康養(yǎng)殖關乎國計民生，豬腸道功能的研究對提高營養(yǎng)的利用率、降低氮排放和增強豬的抵抗力具有重要意義[1，2]。目前，研究腸道功能的方法技術有多種，基本分為在體、離體和體內等幾種方法。由于豬腸粘膜具有高代謝與絨毛微血管結構的特性，對灌注不敏感，所以本實驗室重點介紹在體的小腸灌注技術和離體的尤斯灌流(Ussing chamber)技術在豬腸道功能研究方面的應用。小腸灌注技術是通過建立仔豬的原位模型[3]，在病原菌的感染下研究益生素、益生菌或其他添加劑防治仔豬腸道腹瀉的效果。尤斯灌流技術是用微電極檢測整個細胞膜離子通道變化的電流信號，反映腸道藥物吸收、通透性和分泌情況的變化[4]。因此，本文就這兩種技術的操作、應用和研究進展進行綜述。

1 小腸灌注和尤斯灌流技術

1.1 小腸灌注技術及小腸灌注手術對腸道感染的應用

1.1.1 小腸灌注技術 為了控制仔豬的腸道腹瀉，Nabuurs建立了原位小腸灌注技術[5]，該方法通過檢測小腸的凈流量和電解質濃度來鑒定不同物質在腹瀉上的作用。我們實驗室在加拿大Dr.C.M.NYACHOTI的幫助下，把6mg/kg劑量給予鹽酸氯氨酮肌肉注射。在15min-30min后，動物處于麻醉狀態(tài)，迅速用熱肥皂水清洗試驗動物，然后將試驗動物側位置于手術臺上（左側朝下，右側朝上），加上呼吸面罩，開始使用氣體麻醉。

先用毛剪剃除術部毛發(fā)，再用熱肥皂水洗出術部皮脂。以碘酊棉球在術部中心位置開始作發(fā)散狀螺旋涂抹消毒。稍后用75%酒精棉球如上述同樣方法脫碘。蓋好手術孔巾。手術者事先嚴格洗手、消毒，穿戴好手術衣帽、手套。等待動物進入麻醉期Ⅲ期2級，方可開始手術。

在腹腔處用手術刀作12cm-15cm的縱向切口，依次鈍性分離腹外斜肌、橫直肌和腹內斜肌。到底腹膜層后，由手術者和助手用止血鉗對夾，提起腹膜，使腹膜與內臟分離。用手術剪將腹膜剪開3cm左右小口，然后術者左手食指與中指探入腹腔內抬起腹膜，手術剪在兩指間剪開腹膜，開口大小與皮膚口大小相當。

先找到胃的幽門部，在離幽門部的300cm處用手術線做成標記。線的前一端固定在離幽門部的300cm,另一端順著小腸取出余下空腸，不要破壞腸系膜。在距幽門300cm處剪取20cm-25cm的空腸，上端插入內徑3mm，外徑5mm的皮管，皮管上端連接所需要檢測樣品的玻璃瓶；下端插入內徑5mm，外徑9mm的皮管，皮管下端連接著玻璃瓶收集由上端流出的液體。在仔豬的空腸部位可以建立十個同樣的空腸手術段。

1.1.2 小腸灌注手術對腸道感染的應用 根據(jù)在空腸部位建立的空腸手術片段（圖1）分成感染組和非感染組，感染組以濃度108 cfu/mL的病原菌灌注在空腸內，感染15min。非感染組灌注PBS作為對照。感染后待測樣品用60mL去離子水溶解到所需濃度，同時加入1 g/L的葡萄糖和酪蛋白氨基酸以促進細菌生長。在試驗過程中，60mL的待測樣品用注射器緩慢的從皮管上端推進到空腸，速度控制在8mL/h。整個試驗過程控制在7.5h。試驗結果可通過測定流入和流出液體中鈉離子和氯離子的濃度來確定樣品對滲透壓影響；測定流出液體的總量來研究樣品對凈吸收量的作用；鑒定病原菌的濃度判斷樣品對病原微生物的抑制能力。

圖1 小腸灌注技術示意圖

1.2 尤斯灌流技術的結構和原理

1.2.1 尤斯灌流技術的結構 尤斯灌流系統(tǒng)主要由灌流室、電路系統(tǒng)、數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)以及配套系統(tǒng)組成。常見的灌流室有2、4、6和8室4種類型[6]。根據(jù)工藝不同，又分為循環(huán)式和持續(xù)式，本實驗室擁有循環(huán)式儀器，如圖2。循環(huán)式灌流室包括1個U形管道和2個半室，2個半室中間是1個可嵌合組織樣本且可移動的插件。持續(xù)式灌流室包括2個溶液貯器，通過聚乙烯管道將溶液引入2個半室，并設閥門控制流速。電路系統(tǒng)（圖3）包括用于測量跨上皮電壓和電流電極、與電壓/電流鉗相連的導線以及電壓/電流鉗。電壓/電流鉗由靈敏的首級信號采集片、電流和流體阻抗補償范圍、用于電導/電阻測量的脈沖發(fā)生器、可通過計算機進行儀器控制和數(shù)據(jù)采集的遠程接口以及LED讀數(shù)顯示器組成。

圖2 循環(huán)式尤斯灌流系統(tǒng)示意圖

圖3 循環(huán)式尤斯灌流電路系統(tǒng)示意圖

數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)是一套綜合的數(shù)據(jù)采集與分析軟件包，由數(shù)據(jù)采集硬件、接口電纜及ACQUI R E和ANAL YZE(A&AⅡ)軟件包組成。A&AⅡ在Windows環(huán)境下運行，可測量電流、電壓、電導及阻抗，可同時對1-8個組織進行測量。還包括縮放控制、試驗協(xié)議、事件標記、數(shù)據(jù)析取工具及快速數(shù)據(jù)匯總工具等其他功能。

配套系統(tǒng)包括恒溫水浴箱、5%CO2+95%O2混合氣體循環(huán)系統(tǒng)和注射器等。恒溫水浴箱的技術參數(shù)：功耗為1 kW，水泵流速為6L/min，恒溫波動小于0.5℃。

1.2.2 尤斯灌流技術的基本原理 尤斯灌流系統(tǒng)的基本功能是進行上皮細胞膜離子泵功能和抗?jié)B阻抗測定。上皮組織由密集排列的上皮細胞和少量細胞間質組成，具有極性和緊密連接這兩大區(qū)別于其他組織的特征。極性是因為細胞游離面（或頂面）和基底面結構和功能的分布不均造成的；而緊密連接又稱閉鎖小帶，常見于單層柱狀上皮和單層立方上皮中，位于相鄰細胞間隙的頂端側面，緊密連接除具機械連接作用外，更重要的是封閉細胞間隙，阻止細胞外的大分子物質經(jīng)細胞間隙進入組織內。上皮細胞膜上的蛋白質逆著離子濃度梯度將離子從膜的一側轉運向另一側,轉運過程中產生跨膜電勢，被稱為Vt。產生Vt的前提是上皮細胞膜頂側和基底側離子的分布是非均勻的。細胞膜頂側電勢（Va）和基底側電勢（Vb）之差即為Vt。通過對上皮細胞電流鉗可完成Vt的測定，這就是通常所說的斷路記錄，在研究上皮物質的吸收以及分泌機制方面極為有用。

1.2.3 尤斯灌流系統(tǒng)的具體操作步驟 使用尤斯灌流之前首先進行緩沖液、試驗用溶液的配制，同時制備好電流電極和電壓電極，電極制備過程中注意兩點：一是電極制備應在3%瓊脂糖溶液冷卻之前；二是電極中避免氣泡的存在，若有氣泡應用注射器回吸。在固定上皮組織和加入緩沖液之前，將尤斯灌流系統(tǒng)各個部件安裝好，檢測系統(tǒng)是否滲水。接著插入電極，電極電阻會隨著時間的變化而變化，進而導致電極電阻的不對稱性。因此，試驗開始前應檢測系統(tǒng)噪聲以及補償電壓。目前，多數(shù)尤斯灌流系統(tǒng)都能補償溶液阻抗以及電極電壓。然后固定好上皮組織以及加入緩沖液，開始電參數(shù)記錄。上皮組織由于受機械壓迫導致電參數(shù)(Vt、Isc和Rt)極不穩(wěn)定，需要10min-30 min的時間讓電參數(shù)基線穩(wěn)定下來。一旦電參數(shù)基線穩(wěn)定下來即可開始目的試驗，具體操作程序可參考何流琴等方法[7]。

2 小腸灌注和尤斯灌流室技術在腸道研究中的應用

2.1 小腸灌注技術在腸道研究上的應用

斷奶仔豬腹瀉是養(yǎng)豬業(yè)最主要的危害之一，該病嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，讓其遭受了巨大的經(jīng)濟損失，控制仔豬腹瀉的方法已經(jīng)從添加抗生素轉到研究其新的替代物上，已有的研究主要包括益生元、益生菌、卵黃抗體、天然植物、中草藥提取物等[8]。小腸灌注技術的應用將加快該研究的速度，降低其研究的成本和加強對其作用機制研究的深入。

Kiarie在2008年為了驗證反丁烯二酸(fumaric acid)、氧化鋅(zinc oxide)、卵黃抗體(egg yolk antibodies)和卡巴多司(carbadox)的抗腹瀉效果[9]，以小腸灌注技術為基礎，以腸毒性大腸桿菌為感染源研究了以上物質在空腸中與病原菌的相互作用。其結果證明了PBS對照組與四種不同的添加劑相比，其凈流量更高，電解質損失也更大。推斷了四種物質均具有抗腹瀉的作用。

四種物質的相互比較顯示：凈流量最高的為丁烯二酸，其次是氧化鋅和卡巴多司，卵黃抗體的效果最佳；電解質的損失情況與凈流量結果相似。上述物質也進一步在動物試驗中證明了具有抗腹瀉和抑制病原菌生長的功能。因此原位小腸灌注技術模型能作為一個評估添加劑的技術平臺，研究其抗生素替代物，包括益生元、益生菌、天然植物、卵黃抗體等在抵抗仔豬腹瀉中的作用，為生豬健康養(yǎng)殖提供技術支持。

2.2 尤斯灌流技術在研究腸道功能上的應用

利用尤斯灌流技術在動物營養(yǎng)與生理中應用主要集中在胃腸道屏障功能以及胃腸粘膜物質轉運方面。而胃腸道功能主要集中在胃腸道上皮通透性、內毒素及細菌移位的途徑和機制以及谷氨酰胺(Gln)和益生菌對腸道屏障功能的改善等方面。并且尤斯灌流技術為研究胃腸道物質轉運效率提供了快捷且有效的途徑，研究主要集中在葡萄糖、氨基酸以及礦物元素等物質的轉運方面。而本實驗室目前應用尤斯灌流技術主要研究了賴氨酸、葡萄糖、谷氨酸等物質在腸粘膜中的物質轉運情況。我們實驗室采用16只SD雌性大鼠隨機分成兩組，一組飼喂玉米醇溶蛋白日糧，一組飼喂常規(guī)日糧作為對照組。21d后采取大鼠空腸和回腸黏膜，應用尤斯灌流技術測定賴氨酸的腸道通透轉運效率。其中試驗中為了提高準確性，以甘露醇作為空白對照。當添加1m l含10000μg的Ly s溶液于擴散池，轉運60mi n后，試驗組與對照組比較，空腸和回腸擴散池內Lys含量變化差異極顯著（P=0.003和P=0.001），而接收室內Ly s含量變化差異不顯著（P＞0.05）。同時與對照組相比，試驗組擴散池內空腸和回腸Lys含量分別低13.60%和15.29%，盡管接收室內Lys含量未受影響，但試驗組中L y s由擴散池經(jīng)空腸或回腸向接收室的轉運過程中所消耗的Lys有顯著變化(P=0.006或P=0.001)，分別使Lys消耗量增加28.06%或51.74%。試驗組空腸和回腸Lys損耗率分別為46.55%和51.28%，而對照組空腸和回腸Lys損耗率分別為36.34%和33.79%。由此可表明在不同日糧間對腸粘膜Lys透過量有顯著影響。同時何流琴等研究[7]還發(fā)現(xiàn)日糧缺乏Lys對腸道其他AA通透量也有影響。在轉運液中除Lys出現(xiàn)在尤斯灌流系統(tǒng)的擴散池和接收室以外，還發(fā)現(xiàn)在擴散池和接收室內均測出一些其他AA，即 Arg、His、Thr、Asp、Glu、Ser和 Gly，并且其在空腸和回腸中個別氨基酸有升高或者降低的趨勢。但是目前日糧缺乏Lys對其他氨基酸影響機制仍有待進一步研究。并且由于尤斯灌流技術在我國營養(yǎng)學領域研究甚少，技術分析不成熟，其技術原理仍需進一步探討。

另外本研究組伍力、何流琴[7]等人運用尤斯灌流技術研究了功能性氨基酸對嘔吐毒素應激造成的腸道損傷的緩解作用。該實驗采用了五種不同日糧飼喂動物，對照組飼喂普通日糧，攻毒組仔豬日糧中添加了6ppm的嘔吐毒素，剩余三組仔豬的日糧中分別添加了1%Arg，1%Gln以及精氨酸和谷氨酰胺各0.5%。三個功能性氨基酸組的仔豬提前進行了免疫強化三周后再進行攻毒，經(jīng)尤斯灌流技術測定其腸粘膜轉運葡萄糖和果糖的轉運效率。以考察功能性氨基酸對嘔吐毒素應激的緩解作用。實驗結果表明嘔吐毒素顯著抑制了葡萄糖和果糖的轉運效率，而功能性氨基酸在一定程度上能夠緩解嘔吐毒素對葡萄糖和果糖的轉運效率

3 小腸灌注和尤斯灌流技術在其他方面的應用

3.1 小腸灌注技術對宿主和益生菌的應用

小腸灌注技術除了研究小腸對腹瀉的生理反應之外，還可以通過提取小腸粘膜樣本研究宿主基因組的轉錄組學，分析了相關上調的基因。在益生菌的研究方向，Gross[10]通過小腸灌注技術研究了胚牙乳桿菌（Lactobacillus plantarum）的親本菌株和Mannose-specific adhesin突變菌株對小腸粘膜的粘附和富集影響，在8h的作用下，胚牙乳桿菌Mannose-specific adhesin基因的缺失將會部分失去對腸上皮細胞粘附和富集的能力，導致在感染情況下該凈流量的提高，腹瀉幾率的上升。因此以小腸灌注技術為基礎的試驗可證明益生菌相關基因的功能，這將會為研究益生菌的改造從而提供機體抵抗力提供重要的理論基礎。

由此可知，原位的小腸灌注技術模型不但能快速評估和研究不同抗生素替代品對抵抗腹瀉的作用，而且對于宿主抵抗腹瀉機制的研究和益生菌改造提供重要的技術支持。

3.2 尤斯灌流技術在其他方面的應用

利用尤斯灌流系統(tǒng)研究腸道營養(yǎng)物質吸收和代謝的基礎主要是根據(jù)營養(yǎng)物質可以在腸段特定的位置吸收和通過，測定該特定腸段的營養(yǎng)物質含量，通過有效滲透系數(shù)來評價該藥物吸收的動力學變化。尤斯灌流技術已經(jīng)在畜禽營養(yǎng)與藥物生理學研究領域逐漸成熟，尤其在胃腸道屏障功能及藥物吸收和轉運領域得到應用。但關于尤斯灌流很少涉及細胞學研究，特別是對細胞內藥物吸收與轉運機制的研究。目前藥物在腸道內吸收的研究方法有離體、在體、體內等幾種方法。據(jù)證實Caco-2單層細胞一般認為是藥物轉運研究的一種合適的體外模型，因為這些單層細胞具有小腸黏膜的大多數(shù)酶、功能和形態(tài)學特征[11]。但是應用該模型研究藥物的吸收情況與體內的差異性較大。而尤斯灌流技術為解決這個問題提供了新思路，為細胞學研究提供了新方法[12]。

尤斯灌流系統(tǒng)的研究對象為上皮組織，而上皮組織廣泛分布在身體表面和體內各種囊、管、腔的內表面。上皮組織具有保護、分泌、吸收和排泄等功能，不同部位的不同上皮其功能各有差異。如分布在身體表面的上皮以保護功能為主；體內各管腔面的上皮，除具有保護功能外尚有分泌和吸收等功能；某些上皮組織，從表面生長到深部結締組織中去，分化成為具有分泌功能的腺上皮。因此，尤斯灌流的研究對象可擴展到機體任意上皮組織。就某一具體上皮組織而言，可研究的內容也多樣化，從藥物篩選到屏障功能、免疫功能、物質吸收與代謝及分泌和排泄等。

4 小結

小腸灌注和尤斯灌流室技術的應用是相輔相成的，他們主要都是以腸道作為研究對象，研究其益生物質對腸道的營養(yǎng)吸收和抵抗病原侵襲等方面。小腸灌注技術是以原位的活體形式宏觀的研究腸道的生理變化；尤斯灌流室技術則是通過離體培養(yǎng)形式研究腸道的微觀分子變化?？傊@兩種技術的應用將為益生物質在腸道的健康上提供重要的技術支持和理論基礎。

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