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    硫辛酸對(duì)黃羽肉雞生長(zhǎng)性能、抗氧化能力和免疫功能的影響

    2012-09-04 08:54:04李杏,陳小連,朱麗慧
    關(guān)鍵詞:黃羽硫辛酸飼糧

    規(guī)?;?、集約化養(yǎng)殖為肉雞生產(chǎn)做出重要貢獻(xiàn)的同時(shí),也帶來了嚴(yán)重的隱患,如肉雞體內(nèi)產(chǎn)生大量自由基、發(fā)生氧化應(yīng)激,表現(xiàn)為免疫機(jī)能低下、疾病易感性增加等[1]。生長(zhǎng)期是肉雞機(jī)體的各項(xiàng)功能趨于完善的重要時(shí)期。因此,提高生長(zhǎng)期肉雞抗氧化能力和免疫功能對(duì)減少集約化養(yǎng)殖下肉雞疾病的發(fā)生以及藥物的使用具有重要的意義??寡趸瘎鳛樽杂苫那宄齽?,可以協(xié)助體內(nèi)維持氧代謝平衡,提高機(jī)體抗氧化能力,同時(shí)維持重要免疫細(xì)胞的功能和結(jié)構(gòu)完整性,進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體的免疫機(jī)能[2-3]。硫辛酸,是唯一兼具脂溶性與水溶性的的抗氧化劑,具有很強(qiáng)的抗氧化活性,它可以通過螯合金屬離子、清除自由基、再生內(nèi)源性抗氧化劑來減緩或修復(fù)氧化損傷,也被稱為“萬能抗氧化劑”[4]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于硫辛酸的研究主要集中在人類疾病等的治療和預(yù)防方面,有關(guān)硫辛酸在畜禽飼養(yǎng)和免疫方面的研究報(bào)道還較少[5-6]。為此,本試驗(yàn)以21日齡黃羽肉雞為試驗(yàn)動(dòng)物,旨在通過研究硫辛酸對(duì)其生長(zhǎng)性能、抗氧化能力及免疫功能的影響,為硫辛酸在肉雞生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與材料

    試驗(yàn)選用21日齡體重相近的矮腳黃羽肉雞60只,隨機(jī)分成2組,每組5個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)6只雞。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧,試驗(yàn)組(硫辛酸組)飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加300 mg/kg硫辛酸的試驗(yàn)飼糧,試驗(yàn)期30 d。

    硫辛酸由江蘇省常熟市富士萊醫(yī)藥化工有限公司提供,純度為99%。

    矮腳黃羽肉雞由上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所試驗(yàn)場(chǎng)提供。

    試驗(yàn)基礎(chǔ)飼糧參照美國(guó)NRC(1994)家禽營(yíng)養(yǎng)需要量配制,基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

    表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels ofthe basal diet(air-dry basis) %

    1)預(yù)混料為每千克飼糧提供The premix provided the following per kg of the diet:VA 12 000 IU,VD31 000 IU,VE 60 mg,VB23.0 mg,VB1215 μg,煙酸 nicotinic acid 30 mg,葉酸 folic acid 0.55 mg,生物素 biotin 0.15 mg,泛酸 pantothenic acid 10 mg,膽堿 choline 400 mg,F(xiàn)e 80 mg,Mn 60 mg,Cu 8 mg,Zn 40 mg,Se 0.15 mg,I 0.7 mg。

    2)計(jì)算值 Calculated values。

    1.2 飼養(yǎng)管理

    試驗(yàn)雞采用舍內(nèi)籠養(yǎng)方式,自由采食和飲水。按正常程序防疫和雞舍消毒。

    1.3 樣品采集與制備

    1.3.1血液的采集與樣品制備

    分別于試驗(yàn)第15天和第30天,每個(gè)重復(fù)挑選與該重復(fù)平均體重相近的肉雞1只,翅靜脈采集2管(不含肝素鋰和含肝素鋰)分別為3 mL的血樣,其中不含肝素鋰血樣于3 000 r/min離心15 min制備血清,放入EP管中,置于4℃冰箱保存,用于血清抗氧化指標(biāo)及免疫指標(biāo)的測(cè)定;含肝素鋰血樣為抗凝血,用于淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的測(cè)定。1.3.2 免疫器官采集

    分別于試驗(yàn)第15天和第30天,每個(gè)重復(fù)挑選與該重復(fù)平均體重相近的肉雞1只,屠宰,收集脾臟、胸腺和法氏囊,稱重,用于計(jì)算免疫器官指數(shù)。

    1.4 測(cè)試指標(biāo)和方法

    1.4.1 生長(zhǎng)性能

    試驗(yàn)期間每天記錄雞只死亡情況,以重復(fù)為單位記錄每日投料量和剩余料量,分別于試驗(yàn)第15天和第30天09:00對(duì)試驗(yàn)雞(禁食12 h)進(jìn)行稱重,并計(jì)算各組死亡率、平均采食量、平均日增重和料重比。

    1.4.2 抗氧化能力

    血清谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性、總抗氧化能力(TAOC)以及丙二醛(MDA)含量、一氧化氮(NO)含量、過氧化氫(H2O2)含量、抑制羥自由基(·OH)能力均使用購(gòu)自南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

    1.4.3 免疫功能

    1.4.3.1 免疫器官指數(shù)

    免疫器官指數(shù)(g/kg)=免疫器官重量(g)/

    肉雞活體重(kg)。1.4.3.2 外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率

    將抗凝血先用無鈣鎂Hank’s液作1∶1稀釋,然后移取3 mL人淋巴細(xì)胞分離液于10 mL離心管中,沿管壁緩慢加入2倍體積的稀釋血液,2 500 r/min離心 30 min。取中間白細(xì)胞層約1 mL,加入3~5倍 RPMI-1640完全培養(yǎng)液,洗滌3次,每次2 000 r/min離心10 min,棄上清。將190 μL的淋巴細(xì)胞懸液加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)液中,再加入含10 μL的伴刀豆球蛋白A(ConA)或10 μL的脂多糖(LPS)溶液,每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù),每個(gè)樣品留2個(gè)孔作空白對(duì)照,培養(yǎng)體系每孔共200 μL。于 5%CO2、39 ℃ 下培養(yǎng) 72 h。在培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí),每孔加5 mg/mL噻唑藍(lán)(MTT)10 μL,繼續(xù)培養(yǎng),培養(yǎng)結(jié)束時(shí),每孔再加入100 μL 10%十二烷基磺酸鈉(SDS)-0.04 mol/L氯化氫(HCl)溶液,30 min后用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率=絲裂原刺激孔OD570nm/

    對(duì)照孔OD570nm。

    1.4.3.3 血清免疫球蛋白

    血清免疫球蛋白 A(IgA)、免疫球蛋白 M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)含量均采用免疫比濁法進(jìn)行測(cè)定,試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

    1.5 數(shù)據(jù)處理

    采用 SPSS 13.0軟件的 One-way ANOVA程序?qū)υ囼?yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,分別以P<0.05、P<0.01作為差異顯著與極顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn),結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

    2 結(jié)果

    2.1 硫辛酸對(duì)黃羽肉雞生長(zhǎng)性能的影響

    由表2可以看出,與對(duì)照組相比,硫辛酸對(duì)2個(gè)階段的黃羽肉雞平均日采食量、平均日增重、料重比均無顯著影響(P>0.05)。

    表2 硫辛酸對(duì)黃羽肉雞生長(zhǎng)性能的影響Table 2 Effects of lipoic acid on growth performance of yellow-feathered broilers

    同行同一階段中的數(shù)據(jù)肩注小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05),大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01),無肩注表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

    In the same row,values in the same period with different small letter superscripts mean significant difference(P<0.05),and with different capital letter superscripts mean extremely significant difference(P<0.01),while without letter superscripts mean no significant difference(P>0.05).The same as below.

    2.2 硫辛酸對(duì)黃羽肉雞抗氧化能力的影響

    由表3可見,在試驗(yàn)第15天時(shí),與對(duì)照組相比,硫辛酸組黃羽肉雞血清 T-SOD活性升高了19.57%(P<0.05),NO含量下降了 16.64%(P<0.05)。

    在試驗(yàn)第30天時(shí),與對(duì)照組相比,硫辛酸組黃羽肉雞血清抑制羥自由基能力提高了562.56%(P<0.01),MDA含量降低了20.98%(P<0.05)。

    2.3 硫辛酸對(duì)黃羽肉雞免疫器官指數(shù)的影響

    由表4可以看出,在試驗(yàn)第15天時(shí),與對(duì)照組相比,硫辛酸組黃羽肉雞脾臟指數(shù)提高了29.86%(P<0.05)。

    在試驗(yàn)第30天時(shí),與對(duì)照組相比,硫辛酸對(duì)黃羽肉雞脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、法氏囊指數(shù)均無顯著影響(P>0.05)。

    2.4 硫辛酸對(duì)黃羽肉雞外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響

    由表5可知,在試驗(yàn)第15天時(shí),與對(duì)照組相比,硫辛酸對(duì)由ConA和LPS刺激的黃羽肉雞外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均無顯著影響(P>0.05);在試驗(yàn)第30天時(shí),二者分別提高了16.83%和19.79%(P<0.05)。

    2.5 硫辛酸對(duì)黃羽肉雞血清免疫球蛋白含量的影響

    由表6可以看出,在試驗(yàn)第15天時(shí),與對(duì)照組相比,硫辛酸組黃羽肉雞血清IgG含量提高了34.03%(P<0.01)。

    在試驗(yàn)第30天時(shí),與對(duì)照組相比,硫辛酸組黃羽肉雞IgG含量提高了29.40%(P<0.05)。

    3 討論

    3.1 硫辛酸對(duì)黃羽肉雞生長(zhǎng)性能的影響

    Zhang等[7]研究表明,飼糧中添加300 mg/kg硫辛酸對(duì)愛拔益加肉雞生長(zhǎng)性能無顯著影響(P>0.05),這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。Srilatha等[8]研究也發(fā)現(xiàn),飼糧中添加20、40、60 mg/kg硫辛酸對(duì)肉雞日增重、料重比均無顯著影響(P>0.05)。在本試驗(yàn)中,飼糧中添加300 mg/kg硫辛酸對(duì)整個(gè)試驗(yàn)期間黃羽肉雞平均日采食量、平均日增重、料重比均無顯著影響(P>0.05),這與已有研究結(jié)果相似。

    表3 硫辛酸對(duì)黃羽肉雞血清抗氧化能力的影響Table 3 Effects of lipoic acid on serum antioxidant capacity in yellow-feathered broilers

    表4 硫辛酸對(duì)黃羽肉雞免疫器官指數(shù)的影響Table 4 Effects of lipoic acid on immune organ indices in yellow-feathered broilers g/kg

    表5 硫辛酸對(duì)黃羽肉雞外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響Table 5 Effects of lipoic acid on lymphocyte transformation rate in peripheral blood in yellow-feathered broilers

    3.2 硫辛酸對(duì)黃羽肉雞抗氧化能力的影響

    超氧化物歧化酶(SOD)是機(jī)體清除自由基的一種重要酶,T-SOD活性的高低間接反映了機(jī)體清除自由基的能力。GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物酶,它能催化還原型谷胱甘肽(GSH)變?yōu)檠趸凸入赘孰?GSSG),使有毒的過氧化物還原為無毒的羥基化合物,從而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能不受過氧化物的干擾及損害。脂質(zhì)過氧化最終產(chǎn)物之一是MDA,血清中MDA含量的高低間接反映了機(jī)體細(xì)胞受到自由基攻擊的嚴(yán)重程度。試驗(yàn)動(dòng)物在服用抗氧化劑一段時(shí)間后,可以通過測(cè)定血清或組織中SOD活性、GSH-Px活性、MDA含量等的變化來判斷抗氧 化劑的作用效果[9]。

    表6 硫辛酸對(duì)黃羽肉雞血清中免疫球蛋白含量的影響Table 6 Effects of lipoic acid on serum immunoglobulin content in yellow-feathered broilers μg/mL

    目前,硫辛酸的抗氧化功能已經(jīng)得到證實(shí)。Zhang等[7]研究表明,飼糧中添加300 mg/kg硫辛酸可以顯著降低愛拔益加肉雞血清MDA含量(P<0.01);李建文等[10]研究也發(fā)現(xiàn),肉鴨飼糧中添加150 mg/kg硫辛酸有提高其血漿GSH-Px活性的趨勢(shì)(P=0.077),可以顯著降低其肝臟MDA含量(P<0.05)。在本試驗(yàn)第15天時(shí),硫辛酸組黃羽肉雞血清T-SOD活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05);在第30天時(shí),硫辛酸組黃羽肉雞血清MDA含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05),由此可初步判定300 mg/kg硫辛酸可以在一定程度上改善黃羽肉雞機(jī)體的抗氧化能力。

    隨著現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)集約化程度的提高,動(dòng)物機(jī)體內(nèi)自由基過量產(chǎn)生,引起脂質(zhì)、蛋白質(zhì)氧化損傷,誘導(dǎo)各種疾病的發(fā)生??寡趸瘎┳鳛樽杂苫那宄齽?,可以抑制或減緩自由基或自由基所產(chǎn)生的連鎖反應(yīng)化合物的生成,達(dá)到修復(fù)機(jī)體氧化損傷的作用。因此,自由基的水平也從側(cè)面反映了抗氧化劑抗氧化能力的強(qiáng)弱[11]。NO作為一種氮自由基,攜帶有1個(gè)未配對(duì)電子,極易與氧、超氧陰離子、過氧化氫反應(yīng)生成 NO3-和NO2-。其中NO3-容易質(zhì)子化后迅速分解成具有高反應(yīng)性的羥自由基,誘發(fā)生物膜的多種不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過氧化作用,造成細(xì)胞損傷[12]。在本試驗(yàn)中,第15天硫辛酸組黃羽肉雞血清NO含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05),表明硫辛酸的添加可以在黃羽肉雞21~35日齡顯著減少NO的產(chǎn)生,進(jìn)而減緩脂質(zhì)過氧化作用的發(fā)生,保護(hù)機(jī)體組織不受損傷。羥自由基則是人體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的對(duì)生物體毒性最強(qiáng)、危害最大的自由基,它可以使組織中的糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)發(fā)生氧化,遭受氧化性損傷和破壞,導(dǎo)致細(xì)胞損傷、壞死或突變[13]。抑制羥自由基的能力可以間接反映羥自由基的活性,二者之間為反相關(guān)系。即抑制羥自由基能力越強(qiáng),羥自由基活性越弱;抑制羥自由基能力越弱,羥自由基活性越強(qiáng)。在本試驗(yàn)中,第30天時(shí),硫辛酸組黃羽肉雞血清抑制羥自由基能力顯著高于對(duì)照組(P<0.01),說明硫辛酸的添加可以顯著降低血清中羥自由基的活性,保護(hù)機(jī)體免受損傷。

    從以上結(jié)果可以看出,硫辛酸作為抗氧化劑可以在一定程度上清除機(jī)體自由基,提高肉雞抗氧化水平。

    3.3 硫辛酸對(duì)黃羽肉雞免疫功能的影響

    3.3.1 硫辛酸對(duì)黃羽肉雞免疫器官指數(shù)的影響

    脾臟、胸腺、法氏囊作為禽類主要免疫器官,在機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫中發(fā)揮了極其重要的作用。脾臟是禽類最大的外周免疫器官,聚居著大量B細(xì)胞、T細(xì)胞,是免疫應(yīng)答的重要場(chǎng)所。同時(shí)也是體內(nèi)產(chǎn)生抗體的主要器官,參與全身細(xì)胞免疫和體液免疫。胸腺和法氏囊是禽類的中樞免疫器官,前者主要負(fù)責(zé)T細(xì)胞的成熟和分化,后者則是B細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的部位,主要參與體液免疫。中樞和外周免疫器官發(fā)育狀態(tài)及其機(jī)能強(qiáng)弱直接決定著禽類全身的免疫水平[14]。Rivas等[15]認(rèn)為,脾臟、胸腺及法氏囊的重量可用于評(píng)價(jià)雛雞的免疫狀態(tài),其絕對(duì)重量和相對(duì)重量越大,說明機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫機(jī)能越強(qiáng)。在本試驗(yàn)第15天時(shí),硫辛酸可以促進(jìn)脾臟和胸腺的發(fā)育,其中對(duì)脾臟發(fā)育的影響顯著(P<0.05),表明硫辛酸可以在一定程度上促進(jìn)免疫器官的發(fā)育,進(jìn)而提高機(jī)體免疫水平。

    3.3.2 硫辛酸對(duì)黃羽肉雞細(xì)胞免疫的影響

    硫辛酸作為唯一一個(gè)脂水兼溶的抗氧化劑,在水相和脂質(zhì)中都有較好的溶解性,可以以相當(dāng)高的濃度存在于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外,發(fā)揮清除脂溶性和水溶性自由基的作用,從而保護(hù)脂蛋白及細(xì)胞膜,增強(qiáng)免疫細(xì)胞的完整性,進(jìn)而提高細(xì)胞免疫功 能。Srilatha 等[8]發(fā) 現(xiàn),飼 糧 中 添 加 60、80 mg/kg硫辛酸均可顯著刺激肉雞皮膚嗜堿性粒細(xì)胞過敏反應(yīng)(P<0.05);崔玨等[16]研究也發(fā)現(xiàn),高脂飼糧中添加0.1%硫辛酸可以顯著提高小鼠外周血CD4+/CD8+、B細(xì)胞百分含量(P<0.05),進(jìn)而有效改善慢性氧化應(yīng)激對(duì)免疫系統(tǒng)的損傷,這表明飼糧中添加一定量的硫辛酸可以提高動(dòng)物細(xì)胞免疫水平。檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率也是細(xì)胞免疫研究的一種常用方法。ConA和LPS是常用來檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的絲裂原,作為促分裂因子來檢測(cè)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能,其轉(zhuǎn)化率的高低常作為衡量機(jī)體細(xì)胞免疫水平的指標(biāo)。其中ConA選擇性地刺激T細(xì)胞,而LPS只刺激B細(xì)胞[17]。在本試驗(yàn)中,第30天時(shí),硫辛酸組黃羽肉雞由ConA、LPS刺激的外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05),表明300 mg/kg硫辛酸可以在黃羽肉雞21~35日齡顯著提高其細(xì)胞免疫水平。

    3.3.3 硫辛酸對(duì)黃羽肉雞體液免疫的影響

    免疫球蛋白是具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)上與抗體相似的球蛋白,是一類重要的免疫效應(yīng)分子。家禽主要含有 IgA、IgM、IgG 3種免疫球蛋白。IgA具有抗菌、抗毒、抗病毒作用,占血清免疫球蛋白的10%~20%。IgG是人和動(dòng)物血清中含量最高的免疫球蛋白,占血清免疫球蛋白總量的75%~80%,同時(shí)它也是再次免疫所產(chǎn)生的免疫球蛋白,在體液免疫中最為重要。IgM是分子量最大的免疫球蛋白,是初次體液反應(yīng)早期階段產(chǎn)生的主要的免疫球蛋白,但持續(xù)時(shí)間短,其含量?jī)H占血清免疫球蛋白的10%左右[18]。在本試驗(yàn)中,硫辛酸組黃羽肉雞IgG含量在整個(gè)試驗(yàn)期間均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。作為體液免疫中最重要的免疫球蛋白,IgG含量的提高表明飼糧中添加300 mg/kg硫辛酸可以增強(qiáng)肉雞體液免疫功能。

    4 結(jié)論

    ①飼糧中添加300 mg/kg硫辛酸對(duì)黃羽肉雞的生長(zhǎng)性能無顯著影響。

    ②飼糧中添加300 mg/kg硫辛酸可抑制黃羽肉雞體內(nèi)自由基的產(chǎn)生,在一定程度上提高機(jī)體的抗氧化能力。

    ③飼糧中添加300 mg/kg硫辛酸可以通過提高黃羽肉雞細(xì)胞免疫和體液免疫水平,進(jìn)而改善其免疫功能。

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