高壓氧對腦出血大鼠腦內(nèi)HIF-1α表達(dá)和腦水腫的影響

王愛岳，李 強(qiáng)，周治平，許瓊冠

(1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，海南 海口 570208；2.海南省農(nóng)墾總醫(yī)院神經(jīng)外科，海南 ?？?570311)

腦水腫是腦出血后最主要的繼發(fā)性病理生理改變，有效治療腦水腫是減輕腦繼發(fā)損害、保護(hù)和促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的重要措施[1]。近年來國內(nèi)外學(xué)者對高壓氧(Hyperbaric oxygen，HBO)治療腦出血進(jìn)行了較為廣泛的研究，并且證實HBO有明確的療效，但對其作用的機(jī)制尚不清楚[2]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia inducible factor-1，HIF-1α)是一種隨著細(xì)胞內(nèi)氧濃度變化而調(diào)節(jié)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活因子，任何氧濃度降低的條件下都可誘導(dǎo)細(xì)胞快速、大量的表達(dá)。我們既往的研究曾發(fā)現(xiàn)[3]，HIF-1α在腦出血后血腫周邊腦組織中表達(dá)增加，并且其表達(dá)情況和腦水腫程度密切相關(guān)。但是在HBO作用下，血腫周邊腦組織中HIF-1α的表達(dá)情況目前尚不明了。本實驗擬對HBO作用后血腫周邊腦組織中HIF-1α的表達(dá)變化進(jìn)行研究，探討HBO在治療腦水腫、改善預(yù)后方面的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康SD大鼠88只，體重(250±30)g，雌雄不限，中南大學(xué)實驗動物中心提供；鼠抗兔HIF-1α單克隆抗體購于加拿大Chemicon公司，二抗及DAB顯色試劑盒購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。伊文思蘭(Evane blue，EB)和甲酰胺購于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 88只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對照組(sham組，8只)、腦出血組(ICH組)和腦出血+高壓氧治療組(HBO治療組)(40只)。其中ICH組和HBO治療組根據(jù)出血后時間又平均分為6 h組、24 h組、3 d組、7 d組和14 d組，每組8只。

1.2.2 腦出血動物模型制備 大鼠術(shù)前禁食12 h，10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔內(nèi)注射麻醉。固定大鼠頭部于立體定向儀上，矢狀切開頭皮，暴露右側(cè)頂骨，調(diào)節(jié)定向儀使前后囟處于同一水平面上，于冠狀縫后4 mm、中線旁4 mm，牙鉆鉆一直徑約1 mm的骨孔，硬膜保持完整。微量注射器抽取股靜脈血50 μl，并將微量注射器固定于立體定向儀上沿骨孔垂直刺入腦組織3 mm，緩慢將自體血注入腦內(nèi)，留針15 min后，緩慢拔出穿刺針，骨蠟封閉骨孔，縫合頭皮。假手術(shù)組除不注射自體血外，余操作同上。動物麻醉蘇醒后允許自由進(jìn)食水。

1.2.3 高壓氧處理 HBO治療組大鼠置于DWCI50-300型透明動物實驗艙內(nèi)，純氧洗艙5 min，升壓5 min至0.1 MPa(2個大氣壓)后穩(wěn)壓，吸純氧45 min，減壓10 min。腦出血后3 h行高壓氧治療1次，24 h、3 d、7 d和14 d在每天同一時間行高壓氧治療1次。sham組和ICH組處于常壓空氣環(huán)境中不行高壓氧處理。

1.2.4 標(biāo)本制取 到相應(yīng)時間點再次麻醉動物，動物斷頭后快速于冰盤上取出全腦，冠狀切開腦組織，取血腫周邊腦組織約2 mm×2 mm×2 mm，經(jīng)4%的多聚甲醛固定后石蠟包埋，制成5 μm連續(xù)切片進(jìn)行HE染色和HIF-1α免疫組化染色。另分別取血腫周邊腦組織約100 mg進(jìn)行腦組織含水量測定。

1.2.5 腦組織含水量測定 采用干/濕比重法進(jìn)行腦組織含水量測定。將所取的腦組織以濾紙吸凈其表面血液和腦脊液，分析天平快速稱重后置之于105℃恒溫烤箱內(nèi)烘烤48 h，間隔12 h兩次稱重，重量變化小于0.2 mg時記錄稱量結(jié)果并取其平均值。以換算公式：腦組織含水量(%)=[(腦組織濕重-腦組織干重)/腦組織濕重]×100%，計算腦組織含水量。

1.2.6 HIF-1α免疫組化染色步驟 ①切片常規(guī)脫蠟至水；②新鮮配制的3%H2O2，室溫10 min滅活內(nèi)源性酶；③微波修復(fù)抗原；④滴加封閉液20 min；⑤滴加HIF-1α單克隆抗體37℃反應(yīng)1 h，4℃過夜；⑥生物素化山羊抗小鼠二抗37℃孵育20 min；⑦滴加鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液，37℃反應(yīng)20 min，DAB顯色5 min；⑧蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片。

1.2.7 免疫組化結(jié)果判斷 HIF-1α免疫組化結(jié)果陽性為細(xì)胞核染色，部分細(xì)胞漿染色。參照Remmele等的IRS(Immuno-reactive score)法進(jìn)行計分，高倍鏡下(×400)隨機(jī)選取5個視野，以HIF-1α表達(dá)陽性細(xì)胞率和染色強(qiáng)度的計分之乘積進(jìn)行判斷。陽性細(xì)胞數(shù)所占的百分比為：未著色記為0分，1%～10%記為1分，11%～50%記為2分，51%～80%記為3分，81%～100%記為4分。陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度分為：未著色記為0分，淡黃色記為1分，黃色記為2分，棕黃色記為3分。兩計分相乘為最后結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 HIF-1α在血腫周邊腦組織中的表達(dá)情況 HIF-1α主要表達(dá)于神經(jīng)細(xì)胞胞核，胞質(zhì)中也有少量表達(dá)。sham組腦組織中HIF-1α蛋白呈陰性表達(dá)，ICH組和HBO治療組均可見HIF-1α表達(dá)，與sham組比較，ICH組和HBO治療組HIF-1α表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。HBO治療組與ICH組大鼠腦組織中HIF-1α表達(dá)第14天時比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，其他時間比較，HIF-1α表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)(見表1、圖1、圖2)。

圖1 腦出血14 d HIF-1α在細(xì)胞核中的表達(dá)(SP法×400)

圖2 高壓氧治療14 d HIF-1α在細(xì)胞核中的表達(dá)(SP法×400)

2.2 腦出血后腦組織含水量變化的比較 腦出血3 d內(nèi)，腦組織含水量進(jìn)行性增加且于出血后3 d達(dá)到高峰，此后腦組織含水量逐漸下降。與Sham組相比，ICH組和HBO治療組在出血后各時間點腦組織含水量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。HBO治療組與ICH組大鼠腦組織含水量第14天時比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，其他時間相比較，腦組織含水量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)(見表1)。

表1 腦出血后不同時間觀測指標(biāo)結(jié)果比較(±s，n=8)

表1 腦出血后不同時間觀測指標(biāo)結(jié)果比較(±s，n=8)

注：與sham組腦組織比較，*P＜0.05，與ICH組同時間比較，ΔP＜0.05。

組別 腦出血時間 觀測指標(biāo)腦組織含水量(%)HIF-1α表達(dá)IRS評分6 h 6 h 24 h 3 d 7 d 14 d 6 h 24 h 3 d 7 d 14 d sham組ICH組HBO組77.63±0.68 78.97±1.43*79.86±1.06*80.59±1.14*79.30±1.36*78.39±1.12*77.68±0.91*79.52±1.67*79.91±1.76*79.72±1.74*77.08±1.18Δ 0.00±0.00 3.25±1.58*6.87±3.09*8.62±2.72*7.25±2.37*4.37±2.13*3.37±1.41*4.87±1.64*7.25±2.76*5.12±2.59*2.25±1.58Δ

2.3 HIF-1α蛋白表達(dá)與腦水腫的相關(guān)性 相關(guān)分析顯示，ICH組HIF-1α蛋白表達(dá)與腦水腫的程度成正相關(guān)，r=0.446，P＜0.05；HBO治療組HIF-1α蛋白表達(dá)與腦水腫的程度無相關(guān)性，r=0.319，P＞0.05。

3 討 論

HIF-1是普遍存在于人和哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的缺氧應(yīng)答調(diào)控因子，在調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)的基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用。HIF-1是由α和β大小兩個亞基組成的核轉(zhuǎn)錄因子，其中α亞基為HIF-1所特有，是其主要功能單位，HIF-1的量和活性主要由HIF-1α決定[4]。HIF-1α在常氧狀態(tài)下不穩(wěn)定，半衰期不到5 min，合成后迅速被泛素化，繼而由蛋白酶溶解[5]。而在缺氧狀態(tài)下，HIF-1α在胞漿內(nèi)合成增加，半衰期明顯延長，從而對其下游基因，如：VEGF、MMPs、Glu-1、bax/bcl-2等基因進(jìn)行調(diào)控。目前認(rèn)為，HIF-1α與神經(jīng)細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下抗損傷機(jī)制的產(chǎn)生有密切關(guān)系[6]。

我們在實驗發(fā)現(xiàn)，HIF-1α蛋白在腦血腫周邊神經(jīng)細(xì)胞中有明顯的表達(dá)，其原因可能與腦出血后應(yīng)激反應(yīng)所致的腦血管收縮和血腫壓迫致使血腫周邊腦組織中存在不同程度的缺血、缺氧有關(guān)。而隨著血腫壓迫時間的延長，部分缺血腦組織發(fā)生缺血后再灌注，使得HIF-1α蛋白表達(dá)進(jìn)一步增加。這表明：HIF-1α的表達(dá)與神經(jīng)細(xì)胞缺血、缺氧的時間密切相關(guān)[7]。我們在研究中也發(fā)現(xiàn)，腦出血后HIF-1α蛋白的表達(dá)和腦水腫的變化呈現(xiàn)一致性，相關(guān)分析顯示：出血后HIF-1α蛋白表達(dá)與腦水腫的程度成正相關(guān)關(guān)系(r=0.446，P＜0.05)，這就表明，HIF-1α蛋白參與了出血后腦組織水腫的形成。如能抑制HIF-1α的表達(dá)，將會有效減輕出血后腦水腫的程度。

已有研究表明，在一定的壓力和時間范圍內(nèi)，高壓氧對缺血和水腫的腦組織存在保護(hù)作用[8]。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，腦出血后經(jīng)過高壓氧治療，腦組織中HIF-1α表達(dá)程度及腦水腫程度都有明顯降低，說明高壓氧能有效減少HIF-1α表達(dá)并減輕腦組織水腫程度。但令人感興趣的是，ICH組HIF-1α表達(dá)與腦水腫的程度成正相關(guān)(P＜0.01)，而HBO治療組HIF-1α表達(dá)與腦水腫的程度則無相關(guān)性(P＞0.05)，這表明高壓氧治療腦水腫過程中可能存在多種途徑和機(jī)制，抑制HIF-1α表達(dá)僅是其中一種途徑。而有研究顯示[9]，高壓氧可通過抑制水通道蛋白4(AQP4)的表達(dá)，減輕腦組織的水腫程度。此外我們還發(fā)現(xiàn)：在6 h、24 h、3 d、7 d HBO治療組血腫周邊腦組織中HIF-1α表達(dá)程度和腦水腫程度與對應(yīng)時間點不經(jīng)高壓氧治療的ICH組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而在第14天時差異有統(tǒng)計學(xué)意義，這表明高壓氧治療的效果存在滯后性，早期和每日多次高壓氧處理可能更為有效降低腦組織水腫程度。

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