巨噬細胞遷移抑制因子受體CD74與乳腺癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后的相關(guān)性

張大偉 周亮 章勇

（復(fù)旦大學附屬金山醫(yī)院普外科，上海 201508）

目前評估乳腺癌患者預(yù)后主要根據(jù)乳腺癌原發(fā)腫瘤大小、局部浸潤情況以及腋窩淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移。對乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移潛能差異的分子機制的研究有助于探索評估乳腺癌患者預(yù)后的分子標志物［1］。生理條件下，CD74主要在抗原遞呈細胞表達；除免疫細胞及少數(shù)上皮細胞外，其他組織幾乎不表達CD74分子。研究［2－3］顯示，CD74在B細胞來源的惡性腫瘤以及前列腺癌、胰腺癌等腫瘤中表達顯著升高。本研究通過檢測不同轉(zhuǎn)移潛能的乳腺癌細胞株及乳腺癌患者手術(shù)后石蠟組織標本中CD74的表達情況，探討CD74與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 89例乳腺癌組織取自2007年1月—2009年1月復(fù)旦大學附屬金山醫(yī)院普外科手術(shù)切除標本，均經(jīng)病理學明確診斷。89例乳腺癌患者均為女性；根據(jù)患者整體情況選擇放、化療和內(nèi)分泌治療。89例患者根據(jù)一般資料及相關(guān)病理資料如年齡（≤49歲和＞49歲）、有無腫瘤家族史、腫瘤直徑（＞5 cm和≤5 cm）、病理學類型（浸潤性導(dǎo)管癌和其他病理學類型）、腫瘤分化（Ⅰ～Ⅱ級和Ⅲ級）及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組。術(shù)后第1年每3個月隨訪1次，第2年每6個月隨訪1次，第3年后每年隨訪1次，隨訪截止日期為2011年3月31日或至患者病死。預(yù)后評價指標包括無瘤生存率和總生存率。無瘤生存率按手術(shù)日期至發(fā)現(xiàn)第1次腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移事件日期進行計算，總生存率按手術(shù)日期至腫瘤相關(guān)性病死日期進行計算。

1.2 乳腺癌細胞株中CD74 mRNA及蛋白表達的檢測 抽提 MCF－7和 MDA－MB－231中RNA，將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，同時提取總蛋白。應(yīng)用熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（fluorescent quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q－PCR）檢測細胞株中 CD74 mRNA表達量。用蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）方法檢測細胞系中CD74蛋白表達量。

1.3 乳腺癌組織中CD74分子表達的檢測 手術(shù)切除的標本經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、4μm連續(xù)切片，分別進行HE和免疫組織化學染色。免疫組織化學SP法按SP試劑盒說明進行操作，一抗為兔抗人CD74多克隆抗體，采用檸檬酸緩沖液微波修復(fù)，3，3－二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、固定。用磷酸鹽緩沖液代替一抗作為空白對照，用非免疫血清代替一抗作陰性對照。應(yīng)用英國劍橋大學計算機成像系統(tǒng)（Leica Microsystems Imaging Solutions，Ltd）采集陽性染色圖像（×200）。CD74陽性著色為棕色。采用QWin Plus v3軟件判定4個代表性視野的平均累計光密度，以中位數(shù)為界值，≥中位數(shù)者為陽性表達，＜中位數(shù)者為陰性表達。

1.4 乳腺癌組織學分級和臨床分期標準 組織學分級參照中國抗癌協(xié)會編寫的《新編常見惡性腫瘤診治規(guī)范》。臨床分期參照2002年美國癌癥委員會（第6版）標準。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 15.0軟件進行統(tǒng)計學分析。不同細胞株CD74表達分析用χ2檢驗，病例隨訪資料采用Kaplan－Meier法進行生存分析并得出Log－rank分析結(jié)果，預(yù)后因素采用Cox回歸模型分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌細胞株MCF－7 和 MDA－MB－231 中CD74 mRNA和蛋白表達 在低轉(zhuǎn)移潛能乳腺癌細胞株MCF－7中CD74表達量低，其中mRNA相對表達量（2－ΔCT，ΔCT＝目的基因 CT 值－TBP CT值，TBP為內(nèi)參基因）為（0.0032±0.0007）；在高轉(zhuǎn)移潛能乳腺癌細胞系 MDA－MB－231中CD74表達量較高，其中 mRNA相對表達量為（12.85±0.79）。MCF－7和 MDA－MB－231中CD74 mRNA表達水平有顯著差異（P＜0.001），見圖1A。MCF－7 和MDA－MB－231中蛋白水平相對檢測灰度（蛋白／βactin）有顯著差異（P＝0.009），見圖1B。

2.2 乳腺癌組織中CD74的表達情況 89例乳腺癌組織中44例（49.5%）CD74陰性表達，腫瘤細胞未見陽性染色，見圖2A；CD74陽性表達45例（50.5%），陽性染色定位于腫瘤細胞及部分淋巴細胞、成纖維細胞胞漿中，棕色深染，見圖2B。

圖1 A為FQ－PCR方法檢測乳腺癌細胞系MCF－7和MDA－MB－231中CD74mRNA表達；B為Western Blotting方法檢測乳腺癌細胞株MCF－7和MDA－MB－231的CD74蛋白表達及表達量的比較

圖2 CD74在人乳腺癌組織的表達（×200，DAB染色）

2.3 Kaplan－Meier分析 CD74陰性表達乳腺癌患者總生存率顯著高于陽性表達乳腺癌患者，見圖3。CD74陰性表達乳腺癌患者無瘤生存率顯著高于CD74陽性表達乳腺癌患者，CD74陰性表達乳腺癌患者腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)發(fā)生率顯著低于CD74陽性表達乳腺癌患者，見圖4。

2.4 乳腺癌患者總生存率與無瘤生存率預(yù)測因素單因素Cox比例風險回歸模型分析顯示，與乳腺癌患者總生存率相關(guān)的因素有腫瘤直徑＞5 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、乳腺癌組織CD74高表達，其風險比（hazard ratio，HR）與95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）依次為0.348（0.120～1.012）、0.350（0.140～0.875）、6.925（2.385～20.110）；影響無瘤生存率的因素有腫瘤直徑大于5 cm、腫瘤病理類型為浸潤性導(dǎo)管癌、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及乳腺癌組織CD74高表達，其 HR（95%CI）依次為0.443（0.213～0.918）、1.642（1.137～2.180）、0.527（0.285～0.976）和3.605（1.920～6.766）。

圖3 CD74表達對總生存率影響的比較

圖4 CD74表達對無瘤生存率影響的比較

多因素Cox比例風險模型分析顯示，在校正了年齡、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理學類型后，乳腺癌組織CD74高表達是患者總生存率與無瘤生存的獨立預(yù)測因素，其 HR （95%CI）依次為6.156（2.099～18.057）和3.555（1.860～6.792）。

3 討 論

目前關(guān)于CD74參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的分子學機制的研究尚處于初始階段。Kaufinan等［4］應(yīng)用人化抗CD74抗體HLL1處理荷B細胞瘤的裸鼠后，其腫瘤的生長明顯受抑。作為巨噬細胞遷移抑制因子（migration inhibitory factor，MIF）的受體，CD74與MIF結(jié)合后啟動細胞下游信號級聯(lián)反應(yīng)，促進細胞生存；CD74也可激活核因子－κB（nuclear factor－kappa B，NF－κB），促進細胞增殖。透明質(zhì)酸受體CD44是CD74受體復(fù)合體的必要組成部分，在MIF與CD74結(jié)合過程中透明質(zhì)酸結(jié)合域起到重要作用，從而影響腫瘤的MIF信號傳導(dǎo)，CD44已被證實與乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)［5］。

由于CD74分子具有阻斷MHC－II類分子與內(nèi)源性免疫抗原肽結(jié)合的特性，而腫瘤細胞抗原作為潛在內(nèi)源性抗原分子，當CD74過度表達時，會降低腫瘤細胞的免疫原性，使腫瘤細胞脫離機體免疫監(jiān)視功能得以存活。同時，MIF對腫瘤抑制基因p53具有負調(diào)控作用；MIF與CD74分子結(jié)合后，降低了p53分子的磷酸化水平，導(dǎo)致細胞周期進展及凋亡減少。McClelland等［6］對非小細胞肺癌研究發(fā)現(xiàn)CD74與MIF共表達，MIF／CD74復(fù)合物增加了促血管新生的CXC趨化因子的分泌及腫瘤的血管密度。CD74分子可能通過參與調(diào)控血管生成相關(guān)因子的表達來促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

本研究顯示，乳腺癌高轉(zhuǎn)移潛能細胞株MDAMB－231中 CD74高表達，而低轉(zhuǎn)移潛能細胞株MCF－7 CD74表達量較低，說明CD74在腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移過程中扮演重要角色。CD74是乳腺癌患者無瘤生存率及總生存率的獨立預(yù)測因子，高表達CD74可以用來評估乳腺癌腫瘤進展或不良預(yù)后，指導(dǎo)乳腺癌患者的個體化治療。

［1］ 謝立平，張彧婷，劉冰華，等.乳腺癌組織中nm23和P53的表達與浸潤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)生，2010，48（6）：20－21.

［2］ Meyer－Siegler KL，Iczkowski KA，Leng L，et al.Inhibition of macrophage migration inhibitory factor or its receptor（CD74）attenuates growth and invasion of DU－145 prostate cancer cells［J］.J Immunol，2006，177（12）：8730－8739.

［3］ Nagata S，Jin YF，Yoshizato K，et al.CD74 is a novel prognostic factor for patients with pancreatic cancer receiving multimodal therapy［J］.Ann Surg Oncol，2009，16（9）：2531－2538.

［4］ Kaufman JL，Niesvizky R，Stadtmauer EA，et al.Dose－escalation trial of milatuzumab （humanized anti－CD74 monoclonal antibody）in multiple myeloma［J］.J Clin Oncol，2009，27（15）：85－93.

［5］ Gore Y，Starlets D，Maharshak N，et al.Macrophage migration inhibitory factor induces B cell survival by activation of a CD74－CD44 receptor complex［J］.J Biol Chem，2008，283（5）：2784－2792.

［6］ McClelland M，Zhao L，Carskadon S，et al.Expression of CD74，the receptor for macrophage migration inhibitory factor，in non－small cell lung cancer［J］.Am J Pathol，2009，174（2）：638－646.