長期膽汁反流對大鼠胃黏膜的影響

王學(xué)偉 曹勤 唐劍敏

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院消化內(nèi)科，＊病理科，上海 200062）

長期膽汁反流對胃和食管黏膜的影響尚不明確。研究［1］發(fā)現(xiàn)膽汁反流至胃，甚至食管，十分常見。Dixon等［2］通過病理研究發(fā)現(xiàn)，膽汁反流可能與胃竇黏膜腸化生有關(guān)。近年來研究［3］發(fā)現(xiàn)，膽汁反流不但與反流性食管炎有關(guān)，而且可能是Barrett食管的重要病因，還可能與食管腺癌的發(fā)生有關(guān)［4］。因此，明確長期膽汁反流對胃和食管黏膜的病理影響，具有重要的臨床意義。本研究建立模擬人體生理性膽汁反流途徑的大鼠模型，觀察長期膽汁反流對大鼠胃黏膜的病理影響，通過免疫組化方法研究長期膽汁反流對胃泌素表達(dá)的影響，并探討其在膽汁反流中的作用。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物和抗體 Sprague－Dawley大鼠，清潔級(jí)，雄性，8周齡，體質(zhì)量250～300 g，購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。羊抗大鼠胃泌素多克隆IgG抗體購自美國Santa Cruz公司，兔抗羊IgG抗體購自北京中山公司。

1.2 動(dòng)物模型 大鼠預(yù)適應(yīng)1周，術(shù)前禁食24 h，只給予5%葡萄糖液，術(shù)前6 h禁葡萄糖液。麻醉采用10%水合氯醛0.3 mL／100 g腹腔注射。上腹正中切口4 cm，于十二指腸膽總管開口下0.5 cm處橫斷十二指腸、縫合斷端，于前胃與腺胃交界2 mm處前胃大彎側(cè)作1 cm切口，距Treitz韌帶4 cm遠(yuǎn)側(cè)空腸系膜對側(cè)作1 cm切口，行胃－空腸吻口。術(shù)后24 h禁食，給予5%葡萄糖液，24 h后少量進(jìn)食飼料，3 d后恢復(fù)正常飲食。

1.3 組織病理 模型建立1年后，13只大鼠經(jīng)10%水合氯醛0.3 mL／100 g腹腔注射麻醉，斷頭法處死，大鼠胃經(jīng)10%甲醛固定72 h，石蠟包埋，切片厚度4μm，HE染色。

1.4 免疫組化 切片65℃烘烤1 h，脫蠟、水化，自來水洗10 min，蒸餾水洗2次，蒸餾水浸泡5 min；再將切片放入3%H2O2，室溫孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，自來水洗10 min，蒸餾水洗2次，蒸餾水浸泡5 min；于檸檬酸緩沖液中微波抗原修復(fù)15 min，磷酸緩沖液（PBS）洗，5 min×3次；將切片放入正常血清中，室溫孵育30 min，以封閉內(nèi)源性抗原結(jié)合位點(diǎn)；加入經(jīng)PBS 1：100稀釋的一抗，4℃孵育過夜；PBS洗，5 min×3次；加入二抗，室溫孵育1 h，PBS洗5 min×3次；加入酶標(biāo)物，室溫孵育1 h，PBS洗5 min×3次；加入DAB顯色液，顯色6 s，自來水洗10 min，蘇木素復(fù)染20 s，自來水洗5 min，鹽酸浸泡1 s，自來水洗5 min，室溫晾干，中性樹膠封片。

2 結(jié) 果

2.1 組織病理 正常1年齡大鼠中，僅少數(shù)胃部有輕度慢性炎性反應(yīng)。膽汁反流1年后，13只大鼠腺胃部腺體增生非常顯著，大多數(shù)同時(shí)伴有腺體顯著擴(kuò)張；長期膽汁反流導(dǎo)致3只大鼠腺體發(fā)生異型增生，其中1只出現(xiàn)癌變；膽汁反流大鼠中糜爛和潰瘍少見，僅見于3只和1只大鼠。與此類似，腸化生極少見，僅見于1只大鼠（圖1）。膽汁反流1年后，13只大鼠前胃部鱗狀上皮顯著增生，并伴有明顯角化，其中7只大鼠在黏膜下層形成巨大的角化珠，更有3只大鼠形成角化囊腫；與腺胃部類似，前胃部腸化生極少見，僅見于1只大鼠；所有膽汁反流大鼠前胃均未見到糜爛或潰瘍（圖2）。

2.2 免疫組化 正常大鼠胃泌素陽性染色細(xì)胞主要分布于腺胃胃竇部上皮內(nèi)，并且數(shù)量較少。膽汁反流1年后，腺胃胃竇部上皮內(nèi)胃泌素陽性染色細(xì)胞顯著增生，呈聚集性存在，腺胃胃體部上皮內(nèi)亦可見胃泌素陽性染色細(xì)胞增生（圖3）。

圖1－1 腺胃腺體增生、擴(kuò)張

圖1－2 腺胃腺體異型增生

圖1－3 腺胃腺體癌變

圖1－4 腺胃黏膜糜爛

圖1－5 腺胃潰瘍

圖1－6 腺胃腺體腸化生

圖2－1 前胃鱗狀上皮

圖2－2 前胃鱗狀上皮角化珠

圖2－3 前胃角化囊腫增生、角化

圖2－4 前胃鱗狀上皮腸化生

圖3－1 正常大鼠胃竇胃泌素陽性染色細(xì)胞呈單個(gè)存在

圖3－2 正常大鼠胃體亦有少量胃泌素陽性染色細(xì)胞

圖3－3 長期膽汁反流大鼠胃竇胃泌素陽性染色細(xì)胞增生伴腺體增生

圖3－4 膽汁反流大鼠胃體胃泌素陽性染色細(xì)胞增生伴腺體增生、擴(kuò)張

3 討 論

大鼠的胃由近端的前胃和遠(yuǎn)端的腺胃組成，前胃黏膜被覆鱗狀上皮，與食管相似，腺胃類似于人胃，分為胃體和胃竇。本模型根據(jù)Kaminishi等［5］建立的模型而改進(jìn)，使膽汁通過幽門反流入腺胃，經(jīng)位于前胃的胃－空腸吻合口流入空腸，整個(gè)腺胃保持完整，故類似于人體生理性膽汁反流途徑，不僅便于觀察膽汁反流對腺胃黏膜的影響，還可觀察其對前胃鱗狀上皮的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，長期膽汁反流導(dǎo)致大鼠腺胃胃體和胃竇小凹上皮增生，與1994年休斯頓會(huì)議對反應(yīng)性胃炎（reactive gastritis，RG）的描述一致［6］。所有大鼠腺胃腺體增生，并呈囊狀擴(kuò)張，與Taylor等［7］和 Mukaisho等［8］的發(fā)現(xiàn)一致，提示胃腺體增生、擴(kuò)張是膽汁反流性胃炎的特征。本模型僅發(fā)現(xiàn)1例腺胃癌變，這可能是由于本模型中腺胃是完整的，類似于生理性膽汁反流；而其他模型均將腺胃與空腸吻合，類似于Billroth II手術(shù)，膽汁反流強(qiáng)度可能高于生理性反流，因此胃癌發(fā)生率高。臨床中發(fā)現(xiàn)，兩種不同類型上皮的交界處易發(fā)生腫瘤。在其他模型中，胃癌多發(fā)生于腺胃－空腸吻合口周圍。有研究者認(rèn)為，腸化生是胃黏膜的一種適應(yīng)性改變，當(dāng)胃黏膜的局部微環(huán)境變?yōu)轭愃朴谀c內(nèi)環(huán)境時(shí)，胃黏膜便出現(xiàn)腸化生，以此來減堿性腸液對黏膜的損傷。將帶血管蒂的大鼠胃壁瓣分別移植到腸壁上，移植黏膜發(fā)生典型的腸化生，pH測定發(fā)現(xiàn)移植黏膜的pH＞6，顯著高于胃內(nèi)（一般pH＜4.5）。在腺胃－空腸吻合口周圍，膽汁反流強(qiáng)度可能要高于本模型，造成局部黏膜微環(huán)境的pH顯著升高，因此腸化生發(fā)生率較高。本模型中鱗狀上皮顯著增生，呈乳頭狀凸起，上皮增生形成角化珠和角化囊腫。本模型盡管膽汁反流長達(dá)1年，卻僅有1例腸化生，更無腺癌發(fā)生。此差異可能與手術(shù)方式不同有關(guān)。

膽汁反流可導(dǎo)致高胃泌素血癥，并通過抑制生長抑素的釋放、降低血清生長抑素的水平進(jìn)一步加重高胃泌素血癥；高胃泌素血癥又會(huì)加重膽汁反流?；颊咝心懩仪谐?個(gè)月，其胃竇黏膜G細(xì)胞的數(shù)量即有增加，并存在顯著的膽汁反流性胃炎和小凹上皮增生，這提示膽汁反流可導(dǎo)致G細(xì)胞增生，并引起高胃泌素血癥。通過免疫組化方法，我們發(fā)現(xiàn)本模型中腺胃胃竇和胃體G細(xì)胞顯著增生。膽囊收縮素－2（cholecystokinin，CCK－2）受體是胃泌素的特異性受體，主要表達(dá)于壁細(xì)胞和ECL細(xì)胞。我們推測膽汁反流導(dǎo)致G細(xì)胞增生，引起高胃泌素血癥，在循環(huán)胃泌素的作用下，壁細(xì)胞上的CCK－2受體被激活并分泌HB－EGF和雙調(diào)蛋白等生長因子，促進(jìn)胃上皮增殖，進(jìn)一步導(dǎo)致異型增生和癌變。

綜上所述，我們通過建立模擬人體生理性膽汁反流的大鼠模型發(fā)現(xiàn)，長期膽汁反流能導(dǎo)致腺胃腺體增生并發(fā)生異型增生和癌變，前胃鱗狀上皮亦顯著增生，這可能與長期膽汁反流所致的腺胃G細(xì)胞增生和高胃泌素血癥有關(guān)。

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