鄰苯二甲酸二乙酯對(duì)蟾蜍蝌蚪紅細(xì)胞微核的影響

張維建，石興玲，張超

(1.山東建筑大學(xué) 市政與環(huán)境工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250101;2.山東建筑大學(xué)外語學(xué)院，山東 濟(jì)南 250101)

0 引言

鄰苯二甲酸二乙酯是生產(chǎn)聚氯乙烯的原料。伴隨我國(guó)聚氯乙稀產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，鄰苯二甲酸二乙酯造成的水質(zhì)污染日趨嚴(yán)重。該物質(zhì)已成為水環(huán)境中檢出最多的有機(jī)污染物之一[1]。有關(guān)鄰苯二甲酸酯類(PAES)物質(zhì)的遺傳毒性研究，國(guó)內(nèi)見有胡曉晴、陳如等的報(bào)道，國(guó)外見有M.Mariko，H.K.Mutsuko的報(bào)道[2－9]，但僅限于鄰苯二甲酸二丁酯和鄰苯二甲酸二甲酯等對(duì)魚類、藻類的毒性研究 ，對(duì)蟾蜍蝌蚪紅細(xì)胞微核的影響未見報(bào)道。本文探討了鄰苯二甲酸二乙酯對(duì)蟾蜍蝌蚪的致突變作用，以豐富毒理學(xué)資料。

1 鄰苯二甲酸酯研究概述

鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)(PAES)共有14種，包括鄰苯二甲酸二甲酯、(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二正丁酯(DBP)等，屬有機(jī)化合物，為無色油狀粘稠液體。

地表水和地下水中的鄰苯二甲酸酯主要來源于工業(yè)廢水的排放、PVC塑料的緩慢釋放和新的垃圾滲濾液[7]。鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)主要通過呼吸道、消化道和皮膚粘膜接觸侵入人體[4]。鄰苯二甲酸二乙酯已被美國(guó)環(huán)保署列入環(huán)境激素類物質(zhì)[10]。

2 鄰苯二甲酸二乙酯對(duì)蟾蜍蝌蚪紅細(xì)胞微核影響的實(shí)驗(yàn)研究

2.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用鄰苯二甲酸二乙酯(diethyl phthalate，DEP)，為分析純，購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。分子式:C12H14O4分子量:222.24。

實(shí)驗(yàn)所用中華蟾蜍蝌蚪采自山東建筑大學(xué)映雪湖，平均體重0.22g。試驗(yàn)前將其置2000mL燒杯，暴氣蒸餾水飼養(yǎng)一周，水溫18℃。每天上午投放一次磨細(xì)的餌料，按時(shí)觀察蝌蚪的生理狀態(tài)。

2.2 方法

(1)染毒實(shí)驗(yàn)組采用不同濃度鄰苯二甲酸二乙酯染毒，染毒濃度:1.6μg/mL、3.2μg/mL、6.5μg/mL、13μg/mL、26μg/mL。染毒時(shí)間為 24h。對(duì)照組采用蒸餾水處理。每組10只蝌蚪;實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。

(2)制片取蝌蚪用紗布將體表水分擦干，在前肢和身體連接處斷肢，取血涂片晾干，瑞士染色，光學(xué)顯微鏡觀察。每組制備10張涂片，每片觀察2000個(gè)細(xì)胞，記錄具有微核及核異常的細(xì)胞數(shù)，觀察結(jié)果以千分率(‰)表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Matlable7.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。

微核率=微核總數(shù)/觀察細(xì)胞總數(shù)×1000‰。

核異常細(xì)胞率(ONA‰)=具有核異常(除微核外)的細(xì)胞總數(shù)/觀察細(xì)胞的總數(shù)×1000‰

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)果

3.1.1 不同濃度鄰苯二甲酸二乙酯對(duì)蟾蜍蝌蚪紅細(xì)胞的影響

不同濃度鄰苯二甲酸二乙酯對(duì)蟾蜍蝌蚪紅細(xì)胞微核的影響見表1。

表1 不同濃度鄰苯二甲酸二乙酯對(duì)蝌蚪紅細(xì)胞微核的影響(n=10)

表1 不同濃度鄰苯二甲酸二乙酯對(duì)蝌蚪紅細(xì)胞微核的影響(n=10)

注:* 為 P ＜0.05;＊＊為 P ＜0.01。

鄰苯二甲酸二乙酯濃度/(μg·mL－1)核異常細(xì)胞率/‰0.0(對(duì)照)微核率/‰0.2 ±0.05 0.1 ±0.041.6 0.3 ±0.15 0.2 ±0.143.2 0.4 ±0.05 0.4 ±0.046.5 1.2 ±0.04* 1.3 ±0.05*13. 1.4 ±0.11＊＊ 1.5 ±0.08＊＊26. 1.8 ±0.13＊＊ 1.9 ±0.08＊＊

3.1.2 鄰苯二甲酸二乙酯與蟾蜍蝌蚪紅細(xì)胞微核率及核異常率的相關(guān)分析

鄰苯二甲酸二乙酯與微核率相關(guān)分析顯示，r=0.9187，P ＜0.01，鄰苯二甲酸二乙酯濃度與蝌蚪紅細(xì)胞微核率高度相關(guān)。DEP濃度與蟾蜍蝌蚪紅細(xì)胞核異常率的相關(guān)系數(shù) r=0.9043，P ＜0.01，鄰苯二甲酸的濃度與蟾蜍蝌蚪紅細(xì)胞核異常率高度相關(guān)。

分別以蟾蜍蝌蚪紅細(xì)胞微核率、核異常率為因變量(y)，以鄰苯二甲酸二乙酯濃度為自變量(x)進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程，見表2。

表2 微核率及核異常率與鄰苯二甲酸二乙酯染毒濃度的關(guān)系

不同濃度鄰苯二甲酸二乙酯與蟾蜍蝌蚪紅細(xì)胞微核的劑量—效應(yīng)關(guān)系見圖1。

3.2 討論

3.2.1 鄰苯二甲酸二乙酯對(duì)蟾蜍蝌蚪紅細(xì)胞微核的影響

環(huán)境激素是指由于人類的生產(chǎn)和生活活動(dòng)而釋放到環(huán)境中的、對(duì)人體內(nèi)和動(dòng)物體內(nèi)原本營(yíng)造的正常激素功能施加影響，從而影響內(nèi)分泌系統(tǒng)正常功能的化學(xué)物質(zhì)，通稱“外源性干擾內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)”[10]。在14種鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)中，有6種被美國(guó)環(huán)保局(EPA)列為優(yōu)先控制污染物，鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)首列其中[5]。

由表1可見，鄰苯二甲酸二乙酯濃度升高至6.5 μg/mL時(shí)P＜0.05、對(duì)蝌蚪紅細(xì)胞產(chǎn)生顯著毒性作用，當(dāng)濃度升高至 13μg/mL和 26μg/mL時(shí)，P＜0.01，差異顯著，表明此濃度鄰苯二甲酸二乙酯對(duì)蝌蚪紅細(xì)胞微核有明顯影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，伴隨鄰苯二甲酸二乙酯濃度升高，蟾蜍蝌蚪紅細(xì)胞出現(xiàn)小核，雙核及核皺縮，核質(zhì)外凸、核質(zhì)內(nèi)凹、核碎裂現(xiàn)象。

圖1 鄰苯二甲酸二乙酯對(duì)蟾蜍蝌蚪血紅細(xì)胞微核的影響

由圖1可見，伴隨鄰苯二甲酸二乙酯濃度的升高，蟾蜍蝌蚪紅細(xì)胞微核細(xì)胞率，核異常細(xì)胞率不斷升高。鄰苯二甲酸二乙酯的濃度與微核率之間存在明顯的劑量—效應(yīng)關(guān)系。

3.2.2 建立回歸方程的意義

本實(shí)驗(yàn)分別以鄰苯二甲酸二乙酯濃度為自變量，以受試蟾蜍蝌蚪紅細(xì)胞微核率為因變量，推導(dǎo)出回歸方程。其意義是可根據(jù)水體中兩棲類蝌蚪紅細(xì)胞微核率數(shù)據(jù)，推測(cè)水體鄰苯二甲酸二乙酯類物質(zhì)的濃度，為開展鄰苯二甲酸二乙酯水污染生物監(jiān)測(cè)提供重要依據(jù)。

3.2.3 兩棲類的使用

兩棲類動(dòng)物生活周期復(fù)雜，其幼體及成體均生活在水中。因皮膚濕潤(rùn)，滲透性強(qiáng)，易吸收水體中外源性激素，污染物能在其體內(nèi)富集和放大，使細(xì)胞、組織及生理功能發(fā)生顯著改變，影響其生長(zhǎng)發(fā)育，因此在水體有害物質(zhì)及水質(zhì)的監(jiān)測(cè)中被廣泛用作指示生物。美國(guó)內(nèi)分泌干擾物篩選與檢測(cè)顧問委員會(huì)還建議將兩棲類作為一種模型動(dòng)物用于評(píng)價(jià)內(nèi)分泌干擾物的繁殖和發(fā)育毒性。微核試驗(yàn)是檢查環(huán)境污染物對(duì)細(xì)胞染色體損傷效應(yīng)的一種簡(jiǎn)便快速有效的致突變性篩選方法。蝌蚪細(xì)胞分裂旺盛，研究表明用蝌蚪紅細(xì)胞檢測(cè)水體的環(huán)境污染物致突變時(shí)，其靈敏度要高于魚類微核試驗(yàn)和細(xì)菌學(xué)試驗(yàn)(Ames試驗(yàn))[4]。

3.2.4 鄰苯二甲酸二乙酯毒作用機(jī)理的探討

鄰苯二甲酸二乙酯分子結(jié)構(gòu)與雌激素分子結(jié)構(gòu)類似，可與雌激素競(jìng)爭(zhēng)受體，影響雌激素功能，或影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，使胚胎體內(nèi)雌激素水平改變，導(dǎo)致胚胎性分化過程異常。有實(shí)驗(yàn)證明在生物體內(nèi)，鄰苯二甲酸二乙酯主要代謝為鄰苯二甲酸單酯。鄰苯二甲酸單酯側(cè)鏈越長(zhǎng)，干擾作用越明顯[4]。

4 結(jié)論

鄰苯二甲酸二乙酯可引起蟾蜍蝌蚪紅細(xì)胞微核率升高。在其濃度升高至13μg/mL、26μg/mL時(shí)，紅細(xì)胞微核率明顯升高，與對(duì)照組相比差異顯著P＜0.01。同時(shí)還出現(xiàn)小核，雙核及核皺縮，核質(zhì)外凸、核質(zhì)內(nèi)凹、核碎裂現(xiàn)象。鄰苯二甲酸二乙酯的濃度與微核率之間程高度相關(guān)，存在劑量—效應(yīng)關(guān)系。鄰苯二甲酸二乙酯對(duì)蟾蜍蝌蚪有明顯的至突變作用，可導(dǎo)致蟾蜍蝌蚪紅細(xì)胞染色體的損傷。

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