楊麗娜,趙自剛,趙永泉,劉爭杰,牛春雨,張 靜
(河北北方學院微循環(huán)研究所,基礎(chǔ)醫(yī)學院病理生理學教研室,張家口 075000)
研究表明,腸源性細菌內(nèi)毒素經(jīng)腸淋巴途徑移位至全身是二次打擊、失血性休克導(dǎo)致器官損傷的重要機制[1,2],腸淋巴液是危重病發(fā)展的橋梁[3,4]。我室以“腸缺血/再灌注”概念為基礎(chǔ),把“夾閉腸系膜淋巴管(mesenteric lymph duct,MLD)阻斷淋巴液回流1 h,再行淋巴液灌注”稱為“腸淋巴再灌注”(mesenteric lymph reperfusion,MLR);發(fā)現(xiàn)單純的MLR對機體不造成損害,但可加劇腸系膜上動脈閉塞性(superior mesenteric artery occlusion,SMAO)休克這一病理過程,降低SMAO休克大鼠的平均動脈壓及24 h存活率,引起遠隔多器官功能障礙及組織學損傷[5],其機制與MLR加重多個器官的自由基損傷、一氧化氮釋放、組織細胞膜泵功能障礙有關(guān)[6]。鑒于腸淋巴途徑作為腸源性內(nèi)毒素移位的關(guān)鍵途徑[7],MLR加劇SMAO休克多器官損傷的作用機制是否與內(nèi)毒素經(jīng)腸淋巴途徑的移位有關(guān)值得研究。為此,本文觀察MLR對SMAO休克大鼠多器官內(nèi)毒素(endotoxin,ET)、內(nèi)毒素增敏系統(tǒng)、炎癥介質(zhì)的影響,揭示腸源性內(nèi)毒素移位在MLR加劇SMAO休克多器官損傷中的作用機制。
SPF級Wistar雄性大鼠24只,體重280~330 g,購自中國軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心(實驗動物許可證號SCXK[軍]2007-004)。隨機分為4組(n=6):假手術(shù)組(Sham)、MLR組 、SMAO 組和 SMAO+MLR組。所有大鼠實驗前禁食12h,自由飲水。實驗過程中,動物的處置方法符合動物倫理學標準。
肌肉注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg bw)麻醉大鼠后,剪毛備皮,鋪消毒巾,右股部手術(shù),股動脈插管連壓力換能器接生物信號采集處理系統(tǒng)動態(tài)監(jiān)測平均動脈血壓,股靜脈給予肝素鈉溶液(1 ml/kg bw,即500 U/kg bw)全身抗凝;行腹部手術(shù),暴露腸系膜根部,游離腸系膜上動脈(superior mesenteric artery,SMA),仔細分離與SMA相伴行的腸系膜淋巴管(mesenteric lymphatic duct,MLD)。在血壓穩(wěn)定10 min后,以無創(chuàng)血管夾,夾閉MLD根部1 h、松開再灌注2 h為MLR組;夾閉SMA根部1 h、松開再灌注2 h為SMAO組;同時夾閉SMA與MLD1 h、松開再灌注2 h為SMAO+MLR組;僅分離SMA、MLD,不夾閉者為Sham組。
所有動物在完成再灌注2 h后(Sham組在相當時間點),立即行腹主動脈無菌取血,置于無熱源的肝素抗凝管中,3500 r/min,離心15min,取血漿封存于無熱源玻璃管中,-80℃下冷凍保存。取血后迅速選擇固定位置,無菌留取肝、腎、肺、心等臟器 0.3~0.5 g組織均分兩份,一份加9倍的無熱源水,用無熱源玻璃勻漿器低溫制備組織勻漿,封存于無熱源玻璃管中,-80℃低溫冰箱(美國熱電)冷凍保存,用于檢測內(nèi)毒素含量;另一份加5倍的冷生理鹽水,用高速分散勻質(zhì)機制備組織勻漿(濃度為16.7%),封存于 EP管中,-80℃下冷凍保存,待測CD14、LBP、TNF-α含量。
制作標準曲線:將內(nèi)毒素標準品(中國藥品生物制品檢定所)用檢測用水稀釋至終濃度為2、0.25、0.03125 EU/ml的等比系列標準溶液,分別加入已復(fù)溶的鱟試劑(TAL)反應(yīng)管中,設(shè)置陰性對照管與平行管,放入已預(yù)熱至37℃的內(nèi)毒素檢測儀(ATi 320-06,英國伯萊金耐特有限公司)的反應(yīng)孔內(nèi),檢測波長405 nm,預(yù)設(shè)限值 92%,得到回歸方程 LgT=2.8369-0.2402LgC(T為反應(yīng)時間,C為溶液中細菌內(nèi)毒素濃度),r=-0.9837,陰性對照的反應(yīng)時間>3 600 s大于最低濃度的反應(yīng)時間1664.5 s(圖1)。將待測樣本70℃水浴10 min,3 000 r/min離心10 min取上清。首先,檢測不同標本從原液到最大有效稀釋倍數(shù)的ET含量,根據(jù)ET回收率,確定各標本的最佳有效稀釋倍數(shù)為80倍。其次,根據(jù)稀釋倍數(shù),設(shè)標本陽性對照管(加入0.25 EU/ml的內(nèi)毒素標準液)與平行管,應(yīng)用內(nèi)毒素檢測儀自動采集數(shù)據(jù)及分析,依據(jù)標準曲線,計算ET含量。整個實驗在生物安全柜(美國熱電)中進行無熱源操作,所有與實驗相關(guān)的材料或器具,均去熱源。
Fig.1 Standard curve of endotoxin(ET)
酶聯(lián)免疫(ELISA)方法測定各器官組織勻漿中LBP、CD14、TNFα含量(試劑盒由美國R&D公司生產(chǎn)、江蘇希望生物科技有限公司代理),嚴格按照試劑盒說明書操作流程進行標準曲線制備、樣本測定;終止反應(yīng)后,將酶標板放入酶標儀(Stat Fax-2100型,美國STAT-FAX公司)槽內(nèi),選擇450 nm光波長檢測其OD值,繪制標準曲線后,計算各樣本結(jié)果。組織勻漿蛋白定量采用考馬斯亮蘭法(試劑盒購自南京建成生物工程研究所)。
MLR組血漿ET含量(0.124±0.022 EU/ml)與Sham組(0.115±0.022 EU/ml)比較無顯著性差異(P>0.05);與Sham組和MLR組比較,SMAO組(0.317±0.032 EU/ml)及SMAO+MLR組(0.418±0.066 EU/ml)的血漿ET含量均顯著增高(P<0.01,P<0.05),且SMAO+MLR組ET水平高于SMAO組(P<0.05,圖2)。
MLR組肝、肺、腎、心肌組織勻漿的ET含量與Sham組比較均無顯著性差異(P>0.05);SMAO組及SMAO+MLR組肝、肺、腎、心肌組織勻漿 ET含量均顯著高于Sham組和MLR組(P<0.01,P<0.05),且SMAO+MLR組肝、肺、腎、心肌組織勻漿ET水平高于SMAO組(P<0.01,P<0.05,表1)。
MLR組肝、肺、腎、心肌組織勻漿 LBP、CD14含量與Sham組無明顯差異(P>0.05);SMAO組及SMAO+MLR組肝、肺、腎、心肌組織勻漿的LBP、CD14含量均顯著高于Sham組與MLR組(P<0.01,P<0.05),且 SMAO+MLR組肝 、肺 、腎 、心肌組織勻漿的CD14水平均顯著高于SMAO組(P<0.01,P<0.05,表 2,3)。
Fig.2 Effect of MLR on ET content of plasma in SMAO shock rats(EU/ml, ±s,n=6)
MLR組肝、肺、腎、心肌組織勻漿 TNF-α含量與Sham組無明顯差異(P>0.05);SMAO組及SMAO+MLR組肝、肺、腎、心肌組織勻漿的TNF-α含量均顯著高于Sham組與MLR組(P<0.01,P<0.05),且SMAO+MLR組肝、肺、腎、心肌組織勻漿的TNF-α水平均顯著高于SMAO組(P<0.01,P<0.05,表4)。
Tab.1 Effect of MLR on ET contents of homogenate in SMAO shock rats(EU/ml,±s,n=6)
Tab.1 Effect of MLR on ET contents of homogenate in SMAO shock rats(EU/ml,±s,n=6)
MLR:Mesenteric lymph reperfusion;SMAO:Superior mesenteric artery occlusion**P<0.01 vs sham group;#P<0.05,##P<0.01 vs MLR group;△P<0.05,△△P<0.01 vs SMAO group
Group Liver Lung Kidney Myocardium Sham 0.240±0.058 0.200±0.016 0.151±0.025 0.292±0.063 MLR 0.373±0.049 0.244±0.035 0.188±0.040 0.381±0.082 SMAO 0.645±0.059**## 0.662±0.044**## 0.494±0.083**## 0.595±0.090**#SMAO+MLR 0.728±0.088**##△ 0.892±0.154**##△△ 0.585±0.072**##△ 0.746±0.142**##△
Tab.2 Effect of MLR on CD14 contents of homogenate in SMAO shock rats(ng/g, ±s,n=6)
Tab.2 Effect of MLR on CD14 contents of homogenate in SMAO shock rats(ng/g, ±s,n=6)
MLR:Mesenteric lymph reperfusion;SMAO:Superior mesenteric artery occlusion*P<0.05,**P<0.01 vs sham group;#P<0.05,##P<0.01 vs MLR group;△P<0.05,△△P<0.01 vs SMAO group
Group Liver Lung Kidney Myocardium Sham 1.008±0.123 3.299±0.443 1.237±0.250 1.739±0.463 MLR 1.180±0.093 3.206±0.465 1.355±0.290 1.851±0.385 SMAO 1.521±0.346*# 3.926±0.214*# 1.572±0.453**## 2.794±0.541**##SMAO+MLR 1.921±0.265**##△ 4.223±0.465**##△ 2.182±0.519**##△△ 3.040±0.474**##△
Tab.3 Effect of MLR on LBP contents of homogenate in SMAO shock rats(mg/g,±s,n=6)
Tab.3 Effect of MLR on LBP contents of homogenate in SMAO shock rats(mg/g,±s,n=6)
MLR:Mesenteric lymph reperfusion;SMAO:Superior mesenteric artery occlusion*P<0.05,**P<0.01 vs sham group;#P<0.05,##P<0.01 vs MLR group;△P<0.05,△△P<0.01 vs SMAO group
Group Liver Lung Kidney Myocardium Sham 0.964±0.079 0.812±0.183 0.387±0.082 0.538±0.066 MLR 1.058±0.164 0.831±0.195 0.444±0.093 0.668±0.033 SMAO 1.389±0.145*# 1.089±0.174*# 0.740±0.080*# 1.011±0.196**#SMAO+MLR 1.661±0.100**##△ 1.329±0.079**##△ 0.871±0.120**##△ 1.348±0.180**##△△
Tab.4 Effect of MLR on TNF-αcontents of homogenate in SMAO shock rats(ng/g,±s,n=6)
Tab.4 Effect of MLR on TNF-αcontents of homogenate in SMAO shock rats(ng/g,±s,n=6)
MLR:Mesenteric lymph reperfusion;SMAO:Superior mesenteric artery occlusion*P<0.05,**P<0.01 vs sham group;#P<0.05,##P<0.01 vs MLR group;△P<0.05,△△P<0.01 vs SMAO group
Group Liver Lung Kidney Myocardium Sham 27.90±5.47 36.33±6.54 21.05±3.41 26.58±7.32 MLR 28.05±4.56 38.85±7.90 22.41±4.77 28.87±5.69 SMAO 35.50±5.76*# 48.98±2.50*# 26.68±4.80*# 136.31±7.14**##SMAO+MLR 41.34±8.80**##△△ 56.28±9.27**##△△ 29.98±6.91**##△ 42.84±7.03**##△△
炎癥介質(zhì)大量釋放引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)是多種致病因素導(dǎo)致多器官損傷甚至多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)的關(guān)鍵環(huán)節(jié);內(nèi)毒素移位至遠隔器官刺激單核巨噬細胞系統(tǒng)產(chǎn)生并釋放大量的炎癥介質(zhì)是機體炎癥反應(yīng)失控的主要因素之一[8]。為此,本文從內(nèi)毒素經(jīng)腸淋巴途徑移位的角度,探討MLR加重SMAO休克大鼠多個器官損傷的作用機制。
研究發(fā)現(xiàn),SMAO休克組大鼠血漿以及肝、肺、心、腎等組織中ET的水平顯著增高,提示SMAO休克后器官損傷的機制與內(nèi)毒素移位有關(guān),其主要機制為缺血1 h引起腸粘膜缺血性損傷、再灌注2 h引起腸粘膜的再灌注損傷導(dǎo)致了腸屏障功能障礙,繼而引起了腸源性內(nèi)毒素移位,導(dǎo)致血漿以及遠隔器官中ET水平提高。而行MLD與SMA同時夾閉1 h恢復(fù)再灌2 h的SMAO+MLR組大鼠血漿與肝、肺、心、腎組織勻漿的ET水平高于SMAO組,說明MLR加重了SMAO休克大鼠內(nèi)毒素移位的程度,其作用機制與ET經(jīng)腸淋巴途徑移位增多有關(guān)。實驗結(jié)果從ET角度證實了MLR加重SMAO休克的作用機制與腸源性內(nèi)毒素移位有關(guān),其機制可能與SMAO狀態(tài)下MLR引起了腸系膜微淋巴管損傷、腸源性內(nèi)毒素通過腸系膜微淋巴管吸收和轉(zhuǎn)運增多有關(guān)。
研究表明,LPS不僅直接損傷內(nèi)皮細胞,而且還與LBP相結(jié)合形成LPS-LBP復(fù)合物,在LBP運載下與單核巨噬細胞表面的CD14結(jié)合,激活免疫細胞,產(chǎn)生炎癥介質(zhì)及細胞因子,促進組織損傷,可見,LBP和CD14這一組蛋白與內(nèi)毒素引起炎癥介質(zhì)釋放的作用機制關(guān)系密切[9]。同時,LBP的存在使LPS刺激合成炎癥介質(zhì)TNF-α的閾值下降,并使LPS誘導(dǎo)激活巨噬細胞生成細胞因子的速度較LPS單獨作用時迅速增加,而抗LBP抗體可明顯抑制LPS刺激細胞產(chǎn)生TNF-α的能力;CD14可增強CD14+細胞對LPS的反應(yīng)性;CD14-細胞在轉(zhuǎn)染CD14后對LPS的反應(yīng)性可增強1000倍;可見 LBP/CD14不僅是LPS引起損傷的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵分子,而且具有顯著的LPS增敏效應(yīng),LBP/CD14系統(tǒng)也被稱作內(nèi)毒素增敏系統(tǒng)[10]。本文通過檢測 LBP、CD14、TNF-α的研究發(fā)現(xiàn),SMAO休克組大鼠肝、肺、心、腎等組織LBP、CD14的含量均顯著升高,成為LPS引發(fā)炎癥反應(yīng)的重要環(huán)節(jié),增高的TNF-α則是內(nèi)毒素移位、LBP/CD14增加LPS作用的結(jié)果;SMAO+MLR組大鼠肝、肺、心、腎組織勻漿 LBP、CD14的含量顯著高于SMAO組,提示MLR增加了SMAO休克大鼠內(nèi)毒素致敏系統(tǒng)的活性,這也是最終引起炎癥介質(zhì)TNF-α釋放增多、加重組織器官炎癥反應(yīng)與損傷的重要機制。
綜上,MLR增加了SMAO休克大鼠腸源性ET經(jīng)腸淋巴途徑移位至遠隔器官,同時激活LBP/CD14系統(tǒng),提高器官組織對腸源性ET的敏感性,誘導(dǎo)產(chǎn)生并釋放TNF-α等炎癥介質(zhì),加重炎癥級聯(lián)反應(yīng)與器官損傷,腸源性內(nèi)毒素移位在MLR加劇SMAO休克多器官功能障礙的發(fā)病學中具有重要的作用。研究結(jié)果也提示,通過對LPS-LBP/CD14系統(tǒng)及腸淋巴途徑的干預(yù),可減輕SMAO休克的炎癥級聯(lián)反應(yīng),這對于防治器官損傷具有一定的參考價值及指導(dǎo)意義。
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