新型黑素細胞涂布法移植卡波姆膠載體制備研究

魯嚴，周梅華，李雪，吳迪，王大光，朱文元

（南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院,南京 210029）

自體黑素細胞移植是一種常用的治療穩(wěn)定期白癜風的外科療法，該療法原理是將自身正常表皮的黑素細胞通過體外培養(yǎng)擴增后移植到白癜風皮損處，使此處黑素細胞得以補充、成活，從而在皮損處產(chǎn)生色素。以往該法因細胞懸液滴種時常因受植部位、體位的變化，常常不能均勻分布，復色效果會受到影響，我們擬研制一種以卡波姆（carbomer）膠為基質(zhì)的載體，克服以上缺點，可以用于黑素細胞涂布法移植，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 卡波姆940購自美國Noveon公司，Ham F12培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、胰蛋白酶、分散酶（dispase enzyme）購于美國 Gibco 公司，geneticin（G418）、左旋多巴（Laevodopa,L-DOPA）、12-0-十四酰佛波醇-13-乙酸酯（12-0-Tetradecanoylphorbol 13-acetate,TPA）、 噻 唑 藍 [3-（4,5-Dimethyl-2-Thiazolyl）-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide,MTT]均購于美國Sigma公司。實驗家兔由南京醫(yī)科大學動物實驗中心提供。

1.2 方法

1.2.1 黑素細胞培養(yǎng) 標本來自我院泌尿外科健康男性包皮環(huán)切術后丟棄表皮組織。按照Swope等的方法[1]，去除包皮的皮下組織，并剪成小皮片，經(jīng)Dispase酶4℃消化分離表真皮，表皮經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后獲得單細胞懸液，接種于含常規(guī)黑素細胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于5%CO2培養(yǎng)箱37℃孵育。6 h后換液1次去除未貼壁細胞，48 h后改用不含geneticin的培養(yǎng)基，3天后換液，加入含40 μg/L TPA的黑素細胞培養(yǎng)基進行純化培養(yǎng)。當細胞長滿70%～80%時，用2.5 g/L胰酶消化傳代。黑素細胞鑒定采用 HMB45（human melanoma black-45）和馬森卡塔納氏（Masson-Fontana）染色。

1.2.2 卡波姆膠半固體培養(yǎng)基的配置 稱取卡波姆9 405 g，與500 mL含TPA的培養(yǎng)基混合均勻，即得質(zhì)量分數(shù)為1%卡波姆940黑素細胞載體膠液，注意配制時將卡波姆940干細粉分次撒于培養(yǎng)基液面上，使其充分溶脹，避免結(jié)塊。測定PH，10 mol/L NaOH調(diào)PH至6.5呈凝膠狀。

1.2.3 卡波姆膠對黑素細胞毒性和增殖的影響 （1）對黑素細胞成活率的影響：取對數(shù)生長期的黑素細胞，以濃度5×105/mL 1mL接種于6孔板內(nèi)，加入1%卡波姆940黑素細胞載體膠液進行培養(yǎng)，同時設空白對照。5%CO237℃分別培養(yǎng) 1 h，3 h，6 h，12 h，24 h及36 h后2 500轉(zhuǎn)/min離心15 min收集細胞，TPA黑素細胞培養(yǎng)液洗滌2次，常規(guī)臺盼藍染色測定細胞成活率。（2）對黑素細胞增殖的影響：取對數(shù)生長期的黑素細胞，以濃度5×105/mL 200 μL接種于96孔板內(nèi)，加入1%卡波姆940黑素細胞載體膠液進行培養(yǎng)，同時分別設常規(guī)黑素細胞培養(yǎng)基對照。分別培養(yǎng) 1 h，3 h，6 h，12 h，24 h 及 36 h 后2 500轉(zhuǎn)/min離心15 min，吸棄卡波姆膠后換為常規(guī)黑素細胞培養(yǎng)基，每孔再加入MTT液（5 g/L）20 μL，充分混勻繼續(xù)培養(yǎng)4小時后棄上清液，加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）150 μL，振蕩10 min左右；置酶標儀于490 nm波長測吸光度值（A），細胞增殖率用藥物處理組A值/空白對照組A值的百分數(shù)表示。

1.2.4 卡波姆膠對黑素細胞遷移的影響 Transwell培養(yǎng)板的小室由帶8.0 μm孔徑微孔的聚碳酸酯膜分成上下2室，該膜必須于試驗前1天用含有5 μg纖維連接蛋白的黑素細胞培養(yǎng)液500 μL包被，室溫過夜晾干。將1%卡波姆940黑素細胞載體膠液與黑素細胞（5×105/mL）混合凝膠加于上室（聚碳酸酯膜上），并設空白對照，分別培養(yǎng)6 h，12 h，24 h取出聚碳酸酯膜并用甲醇固定，HE染色，膜上層（未遷移到下層）的黑素細胞及凝膠用棉拭子輕輕擦去，高倍鏡下隨機取4個高倍視野計數(shù)通過8.0 μm孔徑微孔膜遷移到膜下層的黑素細胞。

1.2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進行t檢驗，P<0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 卡波姆膠對黑素細胞毒性和增殖的影響 在1%卡波姆膠作用黑素細胞 1，3，6，12，24 及 36 h后，黑素細胞的成活率和增殖率分別與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見圖1、表1。

表1 卡波姆膠對黑素細胞成活率和增殖率的影響 (n=4,±s）

表1 卡波姆膠對黑素細胞成活率和增殖率的影響 (n=4,±s）

注：與對照組比較，a：P<0.05，b：P＜0.01。

組別對照組1 h 3 h 6 h 12 h 24 h 36 h細胞成活率（%）100 98.79±1.10 97.84±1.66 97.65±1.91 97.03±3.17 96.75±2.62 94.39±4.61細胞增殖率（%）100 96.35±2.40 95.68±2.91 94.24±3.71 93.90±3.94 93.66±4.33 92.79±4.84

2.2卡波姆膠對黑素細胞遷移的影響 1%卡波姆膠作用6 h時分別與對照組和其他時間組比較，黑素細胞的遷移受到抑制，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；1%卡波姆膠作用12 h、24 h分別與對照組比較，黑素細胞的遷移率無明顯差別（P>0.05）；1%卡波姆膠作用24 h黑素細胞的遷移率略強于12 h（P<0.05），結(jié)果見圖2、表2。

表2 1%卡波姆膠作用不同時間對黑素細胞遷移的影響 (n＝5,±s)

表2 1%卡波姆膠作用不同時間對黑素細胞遷移的影響 (n＝5,±s)

時間6 h 1 2 h 2 4 h對照組3 1.3±2.5 5 0.0±7.5 8 6.0±8.9 1%卡波姆膠組1 2.7±4.5 a 4 3.0±4.0 7 4.3±5.7

3 討論

卡波姆 (carbomer)又名聚羧乙烯(carboxy polymethleme,CP)，是一種由丙烯酸與烯丙基蔗糖交聯(lián)而成的高分子聚合物，其化學名為Carboxypolymethylene，卡波姆膠是一種多用途的高分子材料和藥用輔料，在國內(nèi)外被廣泛應用于藥品和化妝品的研制生產(chǎn)，最早由美國Goodrich公司生產(chǎn)，現(xiàn)已收入美、英等國藥典,我國2000年版藥典就已收載[2]?？ú纺z作為黑素細胞涂布法移植的載體國內(nèi)外未有報告。

我們的預實驗表明：采用黑素細胞培養(yǎng)基配置的1%卡波姆膠對黑素細胞共培養(yǎng)1 h，3 h，6 h，12 h，24 h及36 h后，分別用臺盼蘭測定黑素細胞存活率及MTT測定細胞增殖能力，結(jié)果顯示不同時間點測定組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，另Transwell培養(yǎng)板測定發(fā)現(xiàn)1%卡波姆膠在12 h后對黑素細胞遷移無影響。以上結(jié)果顯示采用卡波姆膠混合黑素細胞，不影響體外培養(yǎng)的黑素細胞生物學功能，可以作為新型涂布法移植的細胞載體。

早在1998年有人將組織工程學應用于白癜風細胞移植。Olsson[3]等將制備好的表皮基底細胞懸液均勻的移植到色素脫失部位，外用膠原薄膜封包，膠原膜對黑素細胞的定植生長有益處。以后又有人使用組織工程材料比如羧酸、殼聚糖凝結(jié)成膜包被的培養(yǎng)基，可以明顯改善細胞的生成條件，并減小收獲細胞時對細胞造成的損傷[4-5]。Van GeelN[6]將透明質(zhì)酸摻入到自體黑素細胞懸液中，增加細胞的黏

度，并還可以促進黑素細胞的生長和增殖。近年來，有報告使用羊膜作為移植載體，可用于黑素細胞移植。將培養(yǎng)擴增后的細胞轉(zhuǎn)移到該膜上，培養(yǎng)后應用到色素脫失部位,取得95%以上的復色率[7]。本研究不同于以往組織工程的概念，將卡波姆膠引入作為黑素細胞的載體系統(tǒng)，可以起到很好的固定作用，從而解決現(xiàn)有的黑素細胞移植過程中細胞懸液易流失的問題，減少黑素細胞的流失量，提高植入率并且不會對黑素細胞造成損傷，在臨床應用中，操作簡單安全。另外，由于該化合物本身是優(yōu)良、安全的高分子材料和藥用輔料，型號多樣，可適應多種劑型的特點，如作為凝膠基質(zhì)、生物黏附材料、緩控釋骨架材料等，在藥學領域已經(jīng)廣泛應用[8]，加之具有廉價、容易獲得的特點，經(jīng)以上前期實驗研究結(jié)果證實，對于用于黑素細胞涂布法移植的臨床實施具有十分廣闊的應用前景。

［1］Swope VB,Medrano EE,Smalara D,et al.Long-term pro1iferation of human melanocytes is supported by the physiologic mitogens alpha-melanotropin endothelin-l，and basic fibroblast growth factor.Exp Cell Res,1995,217:453-459.

［2］中華人民共和國藥典（2000年版2部）[M].北京：化學工業(yè)出版社，2000：133.

［3］Olsson MJ,Juhlin L.Leucoderma treated by transplantation of a basal cell layer enriched suspension[J].Br J Dermatol,1998,138:644-648.

［4］Eves PC,Bullett NA,Haddow D,et al.Simplifying the delivery of melanocytes and keratinocytes for the treatment of vitiligo using a chemically definedcarrier dressing[J].J Invest Dermatol,2008,128:1 554-1 564.

［5］Lin SJ,Jee SH,Hsaio WC,et al.Formation of melanocyte spheroids onthechitosan-coatedsurface[J].Biomaterials,2005,26:1413-1422.

［6］van Geel N,Ongenae K,DeMilM,et al.Modified technique of autologous noncultured epidermal cell transplantation for repigmenting vitiligo:a pilot study[J].Dermatol Surg,2001,27:873-876.

［7］Redondo P,del Olmo J,García-Guzman M,et al.Repigmentation of vitiligo by transplantation of autologous melanocyte cells cultured on amniotic membrane[J].Br J Dermatol,2008,158:1 168-1 171.

［8］盧毅，張彤，陶建生.卡波姆在藥劑學中的應用[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志[J]，2007，38（6）：457-460.