IgA 腎病患者外周血Th1、Th2、Th3細胞水平的變化及意義

肖 俊 ，曹春瑜 ，周 靜 ，汪衛(wèi)紅

（南昌大學第一附屬醫(yī)院a.腎內(nèi)科；b.體檢科，南昌 330006）

IgA 腎?。↖gA nephropathy，IgAN）是一種免疫復合物介導的腎小球腎炎，以腎小球系膜區(qū)IgA沉積為主要特征，其臨床病理表現(xiàn)多樣，發(fā)病機制至今仍不清楚。目前認為其發(fā)病主要是由于免疫清除功能受損及黏膜水平抗原清除缺陷，與細胞免疫有著密切關系[1]。 以往研究[2]發(fā)現(xiàn)，IgAN 中存在 Th1/Th2 的失衡，但對是Th1還是Th2占優(yōu)勢仍有爭議，而Th1/Th2失衡在IgAN中的作用亦尚未闡明。Th3細胞是不同于Th l、Th2的一類調(diào)節(jié)性T細胞亞群，具有免疫抑制調(diào)節(jié)功能，除抑制與調(diào)節(jié)免疫效應細胞的增殖、分化和活性，亦可抑制細胞因子產(chǎn)生，主要依賴其分泌的TGF-β1發(fā)揮作用，Th3在IgAN中的作用少見報道。本研究旨在通過觀察IgAN患者外周血中Th1、Th2、Th3的表達變化，探討IgAN免疫失調(diào)的發(fā)病機制。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選擇2011年7月至2012年5月在南昌大學第一附屬醫(yī)院經(jīng)腎活檢確診為IgAN患者（IgAN組）23例，男 8例，女 15例，年齡 22～45歲，病程 1～180個月。其中肉眼血尿5例，單純性鏡下血尿3例，蛋白尿合并血尿17例；合并高血壓5例、水腫4例。均排除過敏性紫癜、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、乙肝病毒相關性腎炎及肝硬化等，1個月內(nèi)均未使用激素及免疫抑制劑。選擇同期在本院體檢的健康體檢者（正常對照組）20例，男6例，女14例，年齡21～43歲。

1.2 方法

1.2.1 臨床指標的檢測

標本采集：1）血標本的采集。2組晨空腹抽取肘靜脈血 5 mL，1 200 r·min-1離心 5 min，取血清，放置-70℃冰箱待測，避免反復凍融。2）尿標本的采集。取清潔晨尿送檢尿常規(guī)；準確收集24 h尿液，加入防腐劑，混勻?；靹蚝?，送檢24 h尿蛋白定量。

檢測方法：采用比色測定法、使用1650生化分析儀（德國Bayer公司）檢測24 h尿蛋白定量、血尿酸及血肌酐水平，試劑盒購自德國Bayer公司；采用免疫比濁法、使用800雙光徑免疫比濁分析儀（美國Beckman Immage公司）檢測血IgA水平，試劑盒購自美國BeckmanImmage公司，并根據(jù)較正的MDRD公式[3]計算腎小球濾過率（eGFR）。

1.2.2 外周血單個核細胞的分離

2組晨空腹抽取肘靜脈血 3～5 mL，肝素鈉抗凝，F(xiàn)icoll（ρ=11 077）密度梯度離心法分離單個核細胞備用。

1.2.3 流式細胞儀檢測Th1、Th2、Th3細胞比例

1）采用RPMI-1640調(diào)整單個核細胞濃度至5×105mL-1，每孔200 μL接種于96孔培養(yǎng)板中。將PMA 25 μg·L-1、ionomycin 1 mg·L-1、monensin 1.7 mg·L-1分別加入96孔培養(yǎng)板中，置37℃、310 CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）中刺激培養(yǎng)5 h。2）CD3、CD8為表面標志，用CD3+CD8+T細胞來代表CD4+T細胞。3)將刺激后的單個核細胞分為陰性對照、IFN-γ、IL-4 及 TGF－β14 管，均加入抗 CD3-PEcy5（美國Biosceince公司）、CD8-FITC （美國Beckman公司）單克隆抗體各10 μL，4℃避光孵育30 min。固定破膜后，再加入抗 IFN-γ-PE、IL-4-PE、TGF－β1－PE 單克隆抗體（美國Biolegend公司）或同型對照IgG1-PE各20 μL，室溫避光孵育15 min。洗滌后，重懸待測。4）流式細胞儀檢測：使用Facscalibur型流式細胞儀（美國Becton Dickinson公司）進行熒光檢測，根據(jù)同型對照調(diào)整電壓，設定陰性范圍。同時，設立3種熒光單獨標記的細胞染色管調(diào)整儀器熒光補償。根據(jù)前向角和側(cè)向角（FSS/SSC）圈定淋巴細胞設門G1，每份標本獲取G1門20 000個細胞測定細胞表達。以CD3陽性設門，分析CD3+CD8-IFN-γ+即Th1細胞、CD3+CD8-IL-4+即 Th2細胞及 CD3+CD8-TGF-β1+即Th3細胞在CD3+T淋巴細胞中的比例。以 Cell-Quest、FlowJo software軟件（美國 Becton Dickinson公司）收集分析數(shù)據(jù)。

1.3 高尿酸血癥的判斷標準

血IgA＞3.45 g·L-1定義為血IgA水平升高。血尿酸男性＞420 μmol·L-1，女性＞350 μmol·L-1定義為高尿酸血癥。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 一般資料

2組的性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。2組一般資料比較見表1。

2.2 外周血 Th1、Th2、Th3、Th1/Th2 細胞水平的變化

IgAN組外周血中Th1細胞比例較正常對照組減少， 差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）；IgAN組外周血中Th2、Th3細胞比例均顯著高于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；IgAN組存在Th1/Th2細胞比例失衡，Th1/Th2細胞比值較正常對照組明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 見表2。

表1 2組一般資料比較

表2 2組Th1、Th2、Th3細胞比例及Th1/Th2細胞比值的比較 ±s

表2 2組Th1、Th2、Th3細胞比例及Th1/Th2細胞比值的比較 ±s

#P＞0.05、*P＜0.05 與正常對照組比較。

組別 n Th1/% Th2/% Th3/% Th1/Th2細胞比值IgAN 組 23 13.14±3.11# 2.17±0.62* 3.17±1.15* 6.05±1.92*正常對照組 20 15.25±4.16 1.42±0.83 2.72±1.03 10.73±5.79

2.3 外周血Th細胞分布頻率與臨床相關性分析

IgAN 組血清 IgA 水平為（3.50±0.90）g·L-1，24 h尿蛋白定量為（0.70±0.60）g·d-1，血尿酸為（359.00±119.00） μmol·L-1，eGFR 為（61.10±42.10）mL·min-1。

相關性分析結果顯示，IgAN組外周血Th2、Th3細胞比例與血清IgA水平呈正相關（r=0.468、0.521，均 P＜0.05），IgAN 組外周血 Th2、Th3 細胞比例與 24 h尿蛋白定量、血尿酸、eGFR水平均無相關性（r=0.016、0.124、-0.323、0.042、0.225、-0.473，均 P＞0.05）。

3 討論

IgAN的發(fā)病與IgA免疫系統(tǒng)的異常密切相關[4]。IgA1由多克隆活性B細胞生成,而B細胞分泌IgA1的過程受T細胞調(diào)控。因此，T細胞免疫調(diào)節(jié)功能的紊亂，可能會導致失控的B細胞產(chǎn)生過量及異常的IgA1。陳琦等[5]通過比較IgAN及非腎炎患者扁桃體T淋巴細胞分布，認為IgAN與扁桃體局部免疫異常有關。近期研究[6]顯示，T細胞尤其是輔助性T細胞的極化改變對IgA糖基化的形式改變及腎臟損害均有直接或間接的影響。由此可見，T細胞的調(diào)控失常可能是致病的IgA1產(chǎn)生的重要環(huán)節(jié)。

輔助性T淋巴細胞（Th）在誘導B細胞增殖分化、促進分泌各種免疫球蛋白中起重要作用。根據(jù)其分泌的細胞因子不同，主要分為Th1、Th2兩個亞群。Th1細胞主要分泌IFN-γ、IL-2等，參與細胞免疫，介導細胞毒T細胞和巨噬細胞的活化，誘導產(chǎn)生分泌IgG2、IgG3的B細胞；Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5等，介導體液免疫，促進產(chǎn)生分泌IgG4、IgE和IgA的B細胞。以往研究[7-10]發(fā)現(xiàn)，Th1/Th2平衡狀態(tài)在腎臟疾病的不同表現(xiàn)類型中改變不同：在ANCA-相關腎小球腎炎、鏈球菌感染后腎小球腎炎、膜增生性腎小球腎炎中，免疫反應以Th1為主導；在微小病變和原發(fā)性膜性腎病中，以Th2為主導的免疫反應占優(yōu)勢。對于Th1/Th2在人類IgA腎病致病中的作用，目前仍有爭議[11]。 多數(shù)研究[12-15]認為，IgAN 中 Th1/Th2平衡向Th2偏倚，促進IgA分泌增多，從而參與IgAN 發(fā)病。 Nogaki F.等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在自發(fā)性產(chǎn)生IgAN的ddY小鼠模型中，幼鼠呈Th1優(yōu)勢，但隨年齡增長卻呈Th2優(yōu)勢，IgA分泌增加。由此認為，IgA的產(chǎn)生可能與Th1/Th2平衡向Th2偏倚有關。Ebihara I.等[13]在單個細胞水平發(fā)現(xiàn)，IgAN 患者外周血分泌Th2類細胞因子的細胞比例增多，也顯示IgAN患者免疫失衡呈Th2優(yōu)勢。另有研究通過ELISA[14]和 RT-PCR 法[15]同樣證實了 IL-4 等 Th2類細胞因子在IgAN中表達增多，但也有少數(shù)研究取得了相反的結果，Lai K.N.等[16-17]用 ELISA 法檢測IgAN患者外周單個核細胞培養(yǎng)上清中的細胞因子，發(fā)現(xiàn)Th1類細胞因子增多。然而，他們在mRNA水平的研究卻又顯示Th1和Th2細胞均增多。筆者通過流式細胞儀多重染色技術檢測IgAN患者外周血Th1、Th2的分泌情況來觀察Th1/Th2的平衡狀態(tài)。結果顯示，IgAN組外周血中Th2細胞比例明顯增高，Th1細胞改變不明顯，Th1/Th2細胞比值明顯降低。證實IgAN存在免疫失衡，Th2優(yōu)勢明顯，且與血IgA的水平呈正相關。

Th3細胞是由口服抗原誘導的小鼠腸系膜淋巴結中分離的一類能產(chǎn)生以TGF-β1為主的、獨特的CD4+調(diào)節(jié)性T細胞亞群[18]，對免疫應答發(fā)揮負調(diào)節(jié)作用，是重要的免疫調(diào)節(jié)細胞。G.J.Prud’homme等[19]研究發(fā)現(xiàn)，Th3 細胞可以抑制 Th1、Th2 細胞過度活化,在糾正Th1/Th2的失衡過程中起重要作用。H.L.Weiner[20]研究發(fā)現(xiàn)，Th3 細胞可以依賴其分泌的TGF-β1，發(fā)揮其抑制Th1細胞介導的免疫應答和炎癥反應。另外，Th3細胞是通過高分泌TGF-β1在維持免疫自穩(wěn)中起著重要作用。楊軍等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在過敏性紫癜患兒急性期外周血Th3細胞減少，可能是導致其免疫失衡的重要原因，但目前少見國內(nèi)外有Th3細胞在IgAN中的報道。以往研究[22]發(fā)現(xiàn)，IgAN患者血清中Th3類細胞因子TGF－β1水平升高，可促進IgA的產(chǎn)生，導致IgAN的發(fā)生。筆者的研究通過流式細胞儀多重染色技術檢測Th3細胞比例，發(fā)現(xiàn)IgAN患者外周血Th3細胞比例增多，且與血清IgA水平呈正相關。因此，推測Th3細胞在外周血中的增多，一方面可能會抑制Th細胞介導的免疫應答反應，造成抗原的持續(xù)存在，引起異常IgA的清除障礙，導致IgA在腎臟的沉積。另一方面可能通過分泌TGF－β1，促使IgA產(chǎn)生增多，參與IgAN的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，本研究結果顯示，IgAN患者外周血中存在Th細胞亞群的分布紊亂，表現(xiàn)為Th1/Th2平衡向Th2偏倚以及外周血中Th3的細胞比例增多。提示，T細胞亞群的分布紊亂可能在IgAN免疫發(fā)病機制中起重要作用，其可能的作用機制尚有待進一步研究。

[1] Galla J H.IgA nephropathy[J].Kidney Int，1995，47（2）：377-387.

[2] Tomino Y.IgA nephropathy：lessons from an animal model，the ddY mouse[J].J Nephrol，2008，21（4）：463-467.

[3] 馬迎春，左力，王梅，等.腎小球濾過率評估方程在慢性腎臟病不同分期中的適用性[J].中華內(nèi)科雜志，2005，44（4）：285-289.

[4] Lai K N.Pathogenesis of IgA nephropathy[J].Nat Rev Nephrol，2012，8（5）：275-283.

[5] 陳琦，李贇.IgA腎病與非腎炎患者扁桃體組織的免疫學比較[J].南昌大學學報：醫(yī)學版，2010，50（6）：13-15.

[6] Chintalacharuvu S R，Yamashita M，Bagheri N，et al.T cell cytokine polarity as a determinant of immunog－lobulin A（IgA）glycosylation and the severity of experimental IgA nephropathy[J].Clin Exp Immunol，2008，153（3）：456-462.

[7] Holdsworth S R，Kitching A R，Tipping P G.Th1 and Th2 T helper cell subsets affect patterns of injury and outcomesinglomerulonephritis[J].KidneyInt，1999，55（4）：1198-1216.

[8] Li H L，Hancock W W，Dowling J P，et al.Activated（IL-2R+）intraglomerular mononuclear cells in crescentic glomerulonephritis[J].Kidney Int，1991，39（4）：793-798.

[9] Masutani K，Tokumoto M，Nakashima H，et al.Strong polarization toward Th1 immune response in ANCA-associated glomerulonephritis[J].Clin Nephrol，2003，59（6）：395-405.

[10] Masutani K，Taniguchi M，Nakashima H，et al.Upregulated interleukin-4 production by peripheral T-helper cells in idiopathic membranous nephropathy[J].Nephrol Dial Transplant，2004，19（3）：580-586.

[11] Johnson R J，Hurtado A，Merszei J，et al.Hypothesis：dysregulation of immunologic balance resulting from hygiene and socioeconomic factors may influence the epidemiology and cause of glomerulonephritis worldwide[J].Am J Kidney Dis，2003，42（3）：575-581.

[12] Nogaki F，Muso E，Kobayashi I，et al.Interleukin 12 induces crescentic glomerular lesions in a high IgA strain of ddY mice,independently of changes in IgA deposition[J].Nephrol Dial Transplant，2000，15（8）：1146-1154.

[13] Ebihara I，Hirayama K，Yamamoto S，et al.Th2 predominance at the single-cell level in patients with IgA nephropathy[J].Nephrol Dial Transplant，2001，16（9）：1783-1789.

[14] Yano N，Endoh M，Takemura F，et al.Involvement of interleukin-4 and soluble CD23 in hypersynthesis of immunoglobulins A and E in patients with IgA nephropathy[J].Nephron，1996，72（1）：44-51.

[15] Ichinose H，Miyazaki M，Koji T，et al.Detection of cyto-kine mRNA-expressing cells in peripheral blood of patients with IgA nephropathy using non-radioactive in situ hybridization[J].Clin Exp Immunol，1996，103（1）：125-132.

[16] Lai K N，Leung J C，Li P K，et al.Cytokine production by peripheral blood mononuclear cells in IgA nephropathy[J].Clin Exp Immunol，1991，85（2）：240-245.

[17] Lai K N，Ho R T，Lai C K，et al.Increase of both circulating Th1 and Th2 T lymphocyte subsets in IgA nephropathy[J].Clin Exp Immunol，1994，96（1）：116-121.

[18] Bayry J，Sibéril S，Triebel F，et al.Rescuing CD4+CD25+regulatory T-cell functions in rheumatoid arthritis by cytokine-targeted monoclonal antibody therapy[J].Drug Discov Today，2007，12（13/14）：548-552.

[19] Prud’homme G J，Piccirillo C A.The inhibitory effects of transforming growth factor-beta-1（TGF-beta1）in autoimmune diseases[J].J Autoimmun，2000，14（1）：23-42.

[20] Weiner H L.Induction and mechanism of action of transforming growth factor-beta-secreting Th3 regulatory cells[J].Immunol Rev，2001，182：207-214.

[21] 楊軍，李成榮，祖瑩，等.調(diào)節(jié)性T細胞在兒童過敏性紫癜發(fā)病機制中的作用初探[J].中華兒科雜志，2006，44（6）：411-414.

[22] Nishikawa Y，Shibata R，Ozono Y，et al.Streptococcal M protein enhances TGF-beta production and increases surface IgA-positive B cells in vitro in IgA nephropathy[J].Nephrol Dial Transplant，2000，15（6）：772-777.