腦缺血再灌注損傷后不同時(shí)間點(diǎn)施眼針對大鼠海馬組織BDNF表達(dá)的影響*

王德山，王 哲，王守巖，馬賢德，高 原，趙金茹，關(guān)洪全

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 110847)

腦缺血再灌注損傷后不同時(shí)間點(diǎn)施眼針對大鼠海馬組織BDNF表達(dá)的影響*

王德山，王 哲，王守巖，馬賢德，高 原，趙金茹，關(guān)洪全

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 110847)

目的:探討眼針治療CIRI的時(shí)間-效果關(guān)系以及可能機(jī)制。方法:應(yīng)用線栓法復(fù)制CIRI大鼠模型，于再灌注后3h、24h及72h進(jìn)行眼針刺激，檢測神經(jīng)功能缺損評分，同時(shí)檢測大腦海馬組織BDNF蛋白及基因表達(dá)。結(jié)果:與模型組比較，眼針組神經(jīng)功能缺損評分降低，同時(shí)海馬組織BDNF表達(dá)呈時(shí)間依賴性上調(diào)(P＜0．01)。結(jié)論:眼針能夠改善CIRI神經(jīng)功能損傷，并具有時(shí)間-效果依賴性，其機(jī)制可能與對抗損傷腦組織BDNF表達(dá)進(jìn)行性下調(diào)有關(guān)。

眼針;大鼠;腦缺血再灌注損傷;腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子;海馬

眼針療法是我國針灸家彭靜山教授于20世紀(jì)70年代始創(chuàng)［1］，依據(jù)中醫(yī)學(xué)基本理論以瞳孔為中心放射形地將眼眶周圍劃分為"八區(qū)十三穴"，并將其與五臟六腑以及上、中、下焦相配屬，根據(jù)疾病所屬臟腑選擇不同穴區(qū)針刺達(dá)到防治疾病的一種微針療法。30余年逾百萬計(jì)病例證明，眼針對多種疾病均有療效［2、3］，特別是對腦缺血致殘性疾病效果突出［4、5］。本研究通過建立大鼠腦缺血再灌注損傷(CIRI)模型，觀察在CIRI后不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行眼針刺激對大鼠神經(jīng)功能缺損評分和海馬組織腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neuro-trophic factor，BDNF)表達(dá)的影響，旨在探討眼針治療 CIRI的時(shí)間-效果關(guān)系，為臨床建立眼針治療CIRI方案提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 動物與分組

健康SPF級SD大鼠120只，雌雄不拘，體質(zhì)量280g±20g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物中心提供(許可證編號SCXK(京)2007-0001)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后分為10組，即正常組、假手術(shù)組、模型組、眼針組分3h、24h、72h各3組，每組12只。模型組和眼針組動物在模型復(fù)制成功后再次進(jìn)行隨機(jī)分組。

1．2 動物模型復(fù)制與評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

參照文獻(xiàn)［6］，模型組及眼針組采用改良的線栓法復(fù)制大鼠大腦中動脈缺血(CIRI)模型，再灌注時(shí)間為缺血 2h后進(jìn)行。CIRI模型成功標(biāo)準(zhǔn):參照Longa評分標(biāo)準(zhǔn)［7］對再灌注后動物進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分。0分為無癥狀;1分為不能完全伸展對側(cè)前爪;2分為向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;3分為向?qū)?cè)傾倒;4分為不能自發(fā)行走，意識喪失。評分為1～3分者納入實(shí)驗(yàn)組，未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)者排除。假手術(shù)組術(shù)式同模型組和眼針組，但是栓塞線插入深度為0．5cm，不進(jìn)行栓塞處理。正常組未做任何處理。

1．3 眼針取穴及刺法眼針取穴參照文獻(xiàn)［8］選取雙側(cè)肝區(qū)、上焦區(qū)、下焦區(qū)、腎區(qū)穴。刺法:用31號13mm毫針，采用橫刺法。于大鼠眼眶外緣處，按照穴區(qū)1→8區(qū)的順序，由穴區(qū)定位線起點(diǎn)進(jìn)針，刺入皮下橫刺到另一穴區(qū)起點(diǎn)線，保持針體在所選穴區(qū)內(nèi)。刺入后不提插捻轉(zhuǎn)，留針20min，留針期間在10min時(shí)刮針柄5次，以加強(qiáng)刺激。治療時(shí)間:3h眼針組于腦缺血再灌注后即刻和取材前30min分別進(jìn)行眼針刺激，計(jì)2次;24h、72h組每間隔12h眼針1次，最終24h組眼針計(jì)4次，72h組眼針計(jì)8次。刺法同3h組。

1．4 試劑

實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa大連寶生物。BDNF引物由北京華大基因公司合成。親和純化兔抗鼠BDNF多克隆抗體、DAB染色試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1．5 檢測指標(biāo)測定

1．5．1 海馬組織BDNF蛋白表達(dá)(Western blot法) 于缺血再灌注損傷3h、24h、72 h給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉后斷頭取出腦組織，去掉小腦，沿兩側(cè)大腦半球連接處將大腦半球切開，剝離出病變側(cè)海馬，按海馬組織凈重∶裂解液 =1∶10的比例，加入相應(yīng)體積的裂解液，pH值為7．5，將樣品剪碎后勻漿、離心、上清即為總蛋白。兔抗鼠BDNF一抗(1∶500);O-dianidine，β-naphthyl acid phosphate 顯色;掃描儀掃描NC膜，分析結(jié)果。

1．5．2 海馬組織 BDNF mRNA的表達(dá) 采用RQ-PCR方法:BDNF上游引物:5'ATGGGTTA CACG AAGGA 3';AQP4下游引物:5'GCCCGAA CATACGATT3'。β-actin為內(nèi)參，其上下游引物分別為:5'CGT GCGTGACATTAAAGAG 3'，5'TTGCCG ATAGTGA TGACCT 3'。所有產(chǎn)物，在 ABI Prism 7500 HT序列檢測系統(tǒng)中運(yùn)行。讀取CT值，以管家基因β-actin為內(nèi)參，以擴(kuò)增倍數(shù)作為比較的依據(jù)，△CT=CT目的基因-CTβ-actin，△△CT=△CT實(shí)驗(yàn)－△CT對照，擴(kuò)增倍數(shù)=2－△△CT。將所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行溶解曲線分析。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2．1 不同時(shí)間點(diǎn)施眼針對模型大鼠神經(jīng)功能缺損評分影響

本實(shí)驗(yàn)過程中大鼠死亡32只，因此最終各實(shí)驗(yàn)組動物樣本數(shù)出現(xiàn)差異。模型復(fù)制成功后動物均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能障礙，如提尾時(shí)左側(cè)前肢不能伸直，行走向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)或傾倒等。假手術(shù)組與正常組大鼠無神經(jīng)功能障礙表現(xiàn)。神經(jīng)功能缺損評分結(jié)果如表1所示，與正常組和假手術(shù)組比較，模型組評分值明顯增高(P＜0．01)。眼針刺激后3h、24h、72h組與模型組比較，神經(jīng)功能缺損評分均較模型組有顯著降低(P＜0．01);其中 3h、24h組評分較72h組更低，但是3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)之間沒有顯著性差異(P ＞0．01)。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)施眼針對模型大鼠神經(jīng)功能缺損評分影響

2．2 不同時(shí)間點(diǎn)施眼針對模型大鼠海馬組織BDNF蛋白表達(dá)的影響

圖1、表2為采用 Western blot方法檢測結(jié)果:取大鼠右側(cè)海馬組織檢測BDNF蛋白，以β-actin為內(nèi)參，模型組海馬組織不同時(shí)間點(diǎn)BDNF蛋白表達(dá)均明顯低于其他各組，并且BDNF蛋白表達(dá)呈現(xiàn)時(shí)間依賴性下調(diào);模型組組內(nèi)3個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較，72h組BDNF蛋白表達(dá)最低(P＜0．01)。眼針組 BDNF蛋白表達(dá)明顯高于模型組(P＜0．01)，其中眼針3h和24h組與72h組比較，72h組明顯低于前2組(P＜0．01)。這可能與腦缺血再灌注損傷72h時(shí) BDNF蛋白表達(dá)下調(diào)更明顯有關(guān)。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)施眼針對模型大鼠海馬組織BDNF蛋白表達(dá)(灰度值)影響

圖1 眼針對腦缺血再灌注損傷模型大鼠海馬組織BDNF蛋白表達(dá)影響

2．3 CIRI后不同時(shí)間點(diǎn)施眼針對大鼠海馬組織BDNFmRNA表達(dá)的影響

采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測海馬組織BDNFmRNA表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)選用 β-actin作為內(nèi)參，BDNF基因擴(kuò)增產(chǎn)物大小為86bp，β-actin基因擴(kuò)增產(chǎn)物為132 bp。其檢測結(jié)果如表3所示，與正常組和假手術(shù)組比較，模型組海馬組織BDNF mRNA表達(dá)明顯減少，并且也呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性下調(diào)，特別是72h組與3h組比較差異顯著(P＜0．01)。與模型組比較，眼針組的3個(gè)時(shí)間點(diǎn) BDNF mRNA均呈現(xiàn)高表達(dá)(P＜0．01)，但3個(gè)時(shí)間點(diǎn)間沒有顯著性差異(P ＞0．01)。

表3 不同時(shí)間點(diǎn)施眼針對模型大鼠海馬組織BDNFmRNA表達(dá)影響(倍數(shù))

3 討論

BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族重要成員之一，是由Barde等在1982年從豬腦中首先分離和純化出的神經(jīng)生長因子。BDNF廣泛分布在腦中樞各個(gè)部位，包括大腦皮層、海馬、基底前腦、紋狀體、下丘腦和小腦等。BDNF不僅分布于神經(jīng)細(xì)胞體內(nèi)，而且延伸到突起纖維中，是腦組織中含量最多的神經(jīng)營養(yǎng)因子之一，具有調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、促進(jìn)成熟、維持神經(jīng)元生長等功能。體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)，BDNF在神經(jīng)元存活、神經(jīng)發(fā)生分化和增殖以及學(xué)習(xí)、記憶等方面扮演著重要的角色［9］。近來研究已表明，BDNF在腦缺血再灌注損傷缺血周邊區(qū)域神經(jīng)元的損傷修復(fù)中發(fā)揮了重要作用［10］。當(dāng)機(jī)體發(fā)生腦缺血再灌注損傷后，其腦神經(jīng)細(xì)胞的損傷程度與BDNF的表達(dá)水平密切相關(guān)，BDNF mRNA表達(dá)水平增強(qiáng)能夠提高神經(jīng)元抗缺血再灌注損傷的能力［11］。從而證明了 BDNF在維持神經(jīng)元功能及其損傷后再生修復(fù)方面發(fā)揮著重要作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組和假手術(shù)組比較，模型組中不論是3h、24h還是72h組的神經(jīng)功能缺損評分均明顯呈現(xiàn)出高值，表明本實(shí)驗(yàn)中的CIRI模型復(fù)制是成功的。與模型組比較，眼針組中3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的神經(jīng)功能缺損評分出現(xiàn)明顯下降，證明眼針治療能夠改善CIRI模型大鼠的神經(jīng)功能以及整體狀態(tài)。

BDNF的檢測結(jié)果表明，模型組3h、24h和72h組海馬組織BDNF不論是蛋白還是基因表達(dá)均呈現(xiàn)時(shí)間依賴遞減性下調(diào)，以缺血再灌注72h時(shí)BDNF表達(dá)下調(diào)最為明顯，提示在腦缺血再灌注損傷后的72h期間，其腦組織損傷程度具有進(jìn)行性加劇的趨勢，即腦缺血再灌注后經(jīng)歷時(shí)間越長腦損傷越加重。經(jīng)過眼針刺激后，伴隨著CIRI模型大鼠整體狀態(tài)的好轉(zhuǎn)其神經(jīng)功能缺損評分也呈現(xiàn)明顯下降，同時(shí)眼針組大鼠海馬組織的BDNF表達(dá)在3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)上也呈現(xiàn)出同步上調(diào)，說明CIRI模型大鼠神經(jīng)功能損傷與腦組織中BDNF表達(dá)下調(diào)具有密切的關(guān)系。比較本實(shí)驗(yàn)中眼針組與模型組相對應(yīng)的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的BDNF表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管模型組BDNF表達(dá)呈時(shí)間依賴性下調(diào)，以 72h達(dá)到最低，但是眼針組BDNF表達(dá)卻沒有出現(xiàn)呈時(shí)間依賴性下調(diào)，即使在72h組其表達(dá)與其他2個(gè)時(shí)間點(diǎn)也并無顯著性差異。此結(jié)果不但表明眼針可能通過增強(qiáng)腦組織BDNF表達(dá)以提高腦組織的抗損傷能力，同時(shí)也提示，眼針治療的次數(shù)增加能夠明顯提高腦組織BDNF表達(dá)以加強(qiáng)眼針的治療效果，即眼針治療存在著“時(shí)間-效果”依賴性關(guān)系。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步認(rèn)為，由于缺血性腦組織的BDNF表達(dá)在腦缺血再灌注后，具有時(shí)間依賴性下調(diào)的現(xiàn)象，這種表達(dá)下調(diào)有加劇神經(jīng)功能缺損的作用。因此，臨床上應(yīng)用眼針治療腦缺血性疾病應(yīng)盡早施行。鑒于眼針對腦缺血再灌注損傷治療存在著“時(shí)-效”性關(guān)系，所以對于腦缺血再灌注性疾病在進(jìn)行早期治療同時(shí)，還應(yīng)該在可能的情況下盡量增加眼針刺激的次數(shù)，以增強(qiáng)眼針的治療效果。

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Effect of Eye acupuncture therapy on BDNF expression in rats with hippocampus ischemia-reperfusion injury at different time periods

WANG De-shan，WANG Zhe，WANG Shou-yan，MA Xian-de，GAO Yuan，ZHAO Jin-ru，GUAN Hong-quan(Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang110847，China)

Objective:To investigate time-effect relationship between eye acupuncture and curative effect of CIRI and the possible mechanisms．Methods:Establishing the rat model of CIRI with suture method．3h，24h and 72h after reperfusion，the neurophysical behaviours were accessed by ZeaLonga neurophysical impairment marks．The methods of Western-blotting and RQ-PCR were taken to detect the alteration of the BDNF protein and BDNF mRNA in rat hippocampus after the eye acupuncture therapy．Results:The expression of the BDNF protein and BDNF mRNA in rat hippocampus after the eye acupuncture therapy was strongly increased at 3h，24h and 72h．The expression of the BDNF at 24h were higher than those at other periods(P ＜ 0．01)．Conclusion:The eye acupuncture therapy can improve the CIRI evidently，the curative effect at 24h is superior to that at 3h and at 72h．It is related to increasing the expression of hippocampus BDNF．．

Eye acupuncture;cerebralischemia-reperfusion injury;brain-deprived neurotrophic factor;hippocampus;real-time fluorescence quantitative polyme rase chain reaction

R245．32+9

B

1006-3250(2012)02-0200-03

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2007CB512702)

王德山(1951-)，男，遼寧大連人，教授，醫(yī)學(xué)碩士，從事中醫(yī)藥對消化道神經(jīng)內(nèi)分泌功能影響機(jī)制研究。

2011-07-27