膈下逐瘀湯對(duì)大鼠纖維化肝組織α-SMA和TGF-β1表達(dá)的影響*

楊 婧，賈 彥，劉 宏，代巧妹，王 蔚，王亞賢，馮 濤，華 東，肖佳音

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，哈爾濱 150040)

膈下逐瘀湯對(duì)大鼠纖維化肝組織α-SMA和TGF-β1表達(dá)的影響*

楊 婧，賈 彥△，劉 宏，代巧妹，王 蔚，王亞賢，馮 濤，華 東，肖佳音

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，哈爾濱 150040)

目的:觀察膈下逐瘀湯抗豬血清誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化作用及其可能的作用機(jī)制。方法:采用豬血清腹腔注射誘導(dǎo)大鼠免疫性肝纖維化模型，VG染色法檢測(cè)肝組織病理學(xué)改變，ELISA檢測(cè)肝組織TGF-β1含量，定量RT-PCR檢測(cè)肝組織TGF-β1和α-SMA mRNA表達(dá)。結(jié)果:與模型組大鼠比較，膈下逐瘀湯可顯著降低豬血清誘導(dǎo)的肝纖維化程度，減少肝組織 TGF-β1蛋白和mRNA表達(dá)，降低肝組織α-SMA mRNA表達(dá)。結(jié)論:膈下逐瘀湯可有效地逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化，其機(jī)制可能與抑制肝星狀細(xì)胞活化有關(guān)。

肝纖維化;膈下逐瘀湯;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1;α-平滑肌肌動(dòng)蛋白

肝纖維化是慢性肝病中常見(jiàn)的一種病理生理過(guò)程，若不積極控制將發(fā)展成肝硬化甚至肝癌。目前越來(lái)越多的基礎(chǔ)和臨床研究證實(shí)，肝纖維化可以逆轉(zhuǎn)［1］。肝纖維化動(dòng)物模型在去除損傷因素后可自動(dòng)恢復(fù)，且慢性肝病患者在去除病因或給予抗病毒治療后肝纖維化可能逆轉(zhuǎn)［2］。學(xué)者們普遍認(rèn)為，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSC)的活化、增殖是肝纖維化形成和發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，對(duì)HSC的干預(yù)已成為防治肝纖維化的核心措施之一［3］。目前，肝纖維化的治療以中藥復(fù)方制劑為主［4］。膈下逐瘀湯為清代醫(yī)家王清任創(chuàng)制的名方，載于《醫(yī)林改錯(cuò)》中，主治膈膜以下、上腹部瘀血積塊等病證，與肝硬化的發(fā)病機(jī)制和病變位置可謂藥證合拍。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝臟病理改變和HSC激活相關(guān)指標(biāo)，明確膈下逐瘀湯防治豬血清誘導(dǎo)的免疫損傷性肝纖維化的效果，初步探討其抗肝纖維化的機(jī)制，為臨床用藥提供可靠依據(jù)。

1 材料

1．1 動(dòng)物

健康成年雄性，Sprague-Dawley大鼠60只，體重200g±10g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供(許可證編號(hào)SCXK京2002-0003)。

1．2 藥品與試劑

膈下逐瘀湯由五靈脂6g、當(dāng)歸9g、川芎6g、桃仁9g、丹皮 6g、赤芍 6g、烏藥 6g、玄胡索 3g、甘草 9g、香附 4．5g、紅花 9g、枳殼 4．5g 等 12 味中藥組成，生藥購(gòu)自齊齊哈爾市中醫(yī)醫(yī)院中藥房，經(jīng)齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥物研究所鑒定無(wú)偽劣品。水煎2次合并藥液，過(guò)濾濃縮，以蒸餾水稀釋至生藥1．5 g/ml貯存，4℃保存?zhèn)溆?。大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1(transforming growth factor β1， TGF-β1)酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 測(cè) 定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(美國(guó)Promega公司，批號(hào) G7590)、豬血清(上海緯群生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20081214)、總 RNA提取試劑 RNAiso Reagent(批號(hào) B13031)及 SYBR ExScriptTMRT-PCR Kit試劑盒(大連寶生物工程有限公司，批號(hào)DRR031A)。

1．3 儀器

MultiskanMk3型酶標(biāo)儀(芬蘭 Thermo Labsystems公司)、ABI7300型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)、UV-2550型紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)、AH-22萬(wàn)能研究顯微鏡(日本SANOY公司)、WELL wash 4MK2洗板機(jī)(芬蘭 Thermo Labsystems公司)、Motic Med 6．0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(北京麥克奧迪圖像技術(shù)有限公司)。

2 方法

2．1 模型制備及給藥

取大鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為空白對(duì)照組(Con)、膈下逐瘀湯組(GD)、豬血清組(PS)、豬血清 +膈下逐瘀湯組(PS+GD)4組。Con組和GD組以NaCl注射液腹腔注射(0．5 ml/只，2次/w)，其余PS組和PS+GD組均以豬血清腹腔注射(0．5 ml/只，2次/w)，連續(xù)12周。各組大鼠于分組后2d開(kāi)始連續(xù)灌胃生理鹽水或膈下逐瘀湯(生藥7．37g/kg·d)，連續(xù)給藥 12 周。

2．2 肝組織學(xué)檢查

最后1次給藥后，大鼠用2%戊巴比妥鈉以2 ml/kg腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，打開(kāi)腹腔，取肝右葉小塊用10%甲醛液固定，石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片并進(jìn)行膠原VG染色。膠原面密度計(jì)算采用Motic Med 6．0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，根據(jù)膠原占視野中肝臟的面積比間接估計(jì)膠原含量，每張切片計(jì)算其面密度(面密度 =膠原面積/肝組織視野面積×100%)。

2．3 ELISA法檢測(cè)肝臟組織中TGF-β1含量

按照 TGF-β1定量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明操作，用Multiskan Mk3型酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)量樣品的光密度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線直線回歸方程式計(jì)算樣品中TGF-β1 含量。

2．4 實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)肝臟組織中 TGF-β1和α-SMA mRNA表達(dá)

肝臟組織加入RNAiso，按說(shuō)明書提取總RNA，1 μl總RNA在20 μl體系中按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)配液為:5 × ExScriptTMBuffer 2 μl，dNTP 0．5 μl，100 μM Random 6 mers 0．5 μl，ExScriptTTMRTase 0．25μl，RNase inhibitor 0．25 μl，Total RNA 0．5 μg，RNase Free dH2O 補(bǔ)到 10 μl。42℃反應(yīng)15 min，95℃加熱 2 min。實(shí)時(shí) PCR反應(yīng)的配液為:SYBR Premix Ex TaqTM25．0 μl，上游引物 1．0 μl，下游引物 1．0 μl，Dye 1．0 μl，模板 cDNA溶液 4．0 μl，dH2O 20．0 μl。反應(yīng)條件設(shè)置為:95℃10s，然后95℃5s、60℃31s進(jìn)行 40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后得出Ct(Threshold cycle)值。參照文獻(xiàn)將Ct值轉(zhuǎn)化為相對(duì)倍數(shù)，基因表達(dá)量采用實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組=2－ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算［5］，其中 ΔΔCt=(Ct目的 － Ct對(duì)照)實(shí)驗(yàn)－(Ct目的 －Ct對(duì)照)對(duì)照。引物序列:α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)上游 5’-CCG AGA TCT CAC CGA CTA CC-3’，下游5’-TCC AGA GCG ACA TAG CAC AG-3’;TGF-β1上游5’-TGC CCT CTA CAA CCA ACA CA-3’，下游5’-GTT GGA CAA CTG CTC CAC CT-3’;3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)上游 5’-GAC AAC TTT GGC ATC GTG GA-3’，下游 5’-ATG CAG GGA TGA TGT TCT GG-3’(大連寶生物工程有限公司合成)。

2．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3．1 膈下逐瘀湯抗肝纖維化的作用

圖1表1顯示，VG染色結(jié)果光鏡下可見(jiàn)細(xì)胞核呈藍(lán)黑色或灰黑色，膠原纖維呈紅色，肌纖維、細(xì)胞漿、紅細(xì)胞呈黃色。PS組大鼠肝組織膠原面積較Con組顯著增加(P＜0.05)，PS+GD組大鼠肝組織膠原面積較PS組顯著減少(P＜0.05)。

圖1 VG染色法觀察膈下逐瘀湯對(duì)肝纖維化的影響(×200)

表1 膈下逐瘀湯對(duì)大鼠纖維化肝組織膠原含量的影響(±s)

表1 膈下逐瘀湯對(duì)大鼠纖維化肝組織膠原含量的影響(±s)

注:與Con組比較:*P ＜0.05;與PS組比較:#P ＜0.05(Con:空白對(duì)照，GD:膈下逐瘀湯，PS:豬血清)

組 別 例數(shù) 膠原面積(%)Con 15 0．71 ± 0．27 GD 15 0．73 ± 0．28 PS 13 9．37 ± 2．91*PS+GD 14 5．90 ± 1．37*#

3．2 膈下逐瘀湯對(duì) TGF-β1表達(dá)的影響

表2圖2顯示，與 Con組比較，PS組大鼠肝組織勻漿中 TGF-β1含量顯著升高(P ＜0.05)。與PS組比較，PS+GD組大鼠肝組織勻漿中 TGF-β1含量顯著降低(P＜0.05)。我們進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)肝組織 TGF-β1 mRNA表達(dá)，肝組織TGF-β1 mRNA表達(dá)與蛋白表達(dá)結(jié)果相符合。

3．3 膈下逐瘀湯對(duì)α-SMA mRNA表達(dá)的影響

圖2表2顯示，與 Con組相比，PS組大鼠肝組織中α-SMA mRNA表達(dá)顯著升高(P ＜0.05)。與PS組比較，PS+GD組大鼠肝組織 α-SMA mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。

4 討論

膈下逐瘀湯方出自清代著名醫(yī)家王清任所著《醫(yī)林改錯(cuò)》，由五靈脂、當(dāng)歸、川芎、桃仁、丹皮、赤芍、烏藥、玄胡索、甘草、香附、紅花、枳殼等12味藥物組成，具有活血祛瘀、行氣止痛之功效。本方以逐瘀活血和行氣藥物居多，使氣帥血行，更好地發(fā)揮其活血逐瘀作用，在臨床上治療肝硬化有確切療效［6］。本實(shí)驗(yàn)病理學(xué)結(jié)果顯示，在致病因素未祛除、豬血清持續(xù)作用的條件下，PS+GD組大鼠肝組織病理組織學(xué)改變明顯好于PS組，表明膈下逐瘀湯對(duì)PS誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展均有治療和延緩作用。

圖2 各組樣本TGF-β1和α-SMA mRNA的擴(kuò)增曲線

表2 膈下逐瘀湯對(duì)大鼠纖維化肝組織TGF-β1和α-SMA基因表達(dá)的影響(±s)

表2 膈下逐瘀湯對(duì)大鼠纖維化肝組織TGF-β1和α-SMA基因表達(dá)的影響(±s)

注:與Con組比較:*P ＜0.05;與PS組比較:#P ＜0.05(Con:空白對(duì)照，GD:膈下逐瘀湯，PS:豬血清)

組 別 TGF-β1含量(ng/g liver)TGF-β1 mRNA表達(dá)(2 －ΔΔCt)α-SMA mRNA表達(dá)(2 －ΔΔCt )Con 4．47 ±0．43 1．21 ±0．29 1．25 ±0．24 GD 4．15 ±0．39 1．14 ±0．18 1．47 ±0．24 PS 16．95 ±1．59* 2．71 ±0．54* 3．35 ±0．33*PS+GD 10．24 ±0．77*# 2．32 ±0．42*# 2．22 ±0．14*#

肝纖維化發(fā)生發(fā)展的主要原因在于肝損傷期間ECM的沉積和降解的動(dòng)態(tài)平衡被打破。HSC活化合成大量ECM是肝纖維化形成的直接原因，也是肝纖維化發(fā)生的核心環(huán)節(jié)［7］。HSC活化也是肝纖維化的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)［8］，因此抑制HSC活化在防治慢性肝病和抗肝纖維化中具有重要意義。TGF-β1是組織損傷后的強(qiáng)效致纖維化因子［9］。肝臟中 TGF-β1是各種TGF-β異構(gòu)體中最主要的存在形式，TGF-β1含量較 TGF-β2、TGF-β3多約 10倍，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞受損后釋放的TGF-β1是啟動(dòng)鄰近靜息態(tài)HSC激活和轉(zhuǎn)化的初始信號(hào)之一［10］。研究表明，將編碼活性TGF-β的基因載體轉(zhuǎn)入裸鼠肝臟后，可導(dǎo)致所有主要器官纖維化，提示TGF-β具有使組織發(fā)生纖維化的病理作用［11］。TGF-β1可以上調(diào) HSC表達(dá) I型、III型、IV型膠原、纖維連接蛋白、層黏蛋白透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、釋放細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)，包括TGF-β1自身形成 TGF-β1的自分泌環(huán)路，從而促進(jìn)靜息HSC激活［12］。病理情況下，細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞來(lái)源是HSC，其激活和增生在肝纖維化過(guò)程中起主要作用［13］，是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)。激活的HSC的特點(diǎn)之一是表達(dá)α-SMA，α-SMA常作為 HSC激活的標(biāo)志物［14］。本研究 ELISA和PCR結(jié)果顯示，大鼠肝纖維化模型肝組織中TGF-β1 mRNA表達(dá)和蛋白含量明顯增加，給予膈下逐瘀湯干預(yù)后，TGF-β1 mRNA表達(dá)和蛋白含量明顯降低。α-SMA mRNA在PS組大鼠肝組織表達(dá)上調(diào)，在 PS+GD組大鼠肝組織表達(dá)明顯減少，表明膈下逐瘀湯可抑制 HSC的活化、增殖和產(chǎn)生 TGF-β1。本研究結(jié)果提示，膈下逐瘀湯抗肝纖維化的作用機(jī)理可能是阻止星狀細(xì)胞活化，進(jìn)而抑制星狀細(xì)胞自分泌TGF-β1這一主要的肝纖維化促進(jìn)因子，減緩星狀細(xì)胞活化的維持和持續(xù)放大，發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

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Effects of Gexia Zhuyu Tang on expressions of α-SMA and TGF-β1 in fibrous liver tissues of rats

YANG Jing，JIA Yan，LIU Hong△，DAI Qiao-mei，WANG Wei，WANG Ya-xian，F(xiàn)ENG Tao，HUA Dong，XIAO Jia-yin
(Department of Pathology，School of Basic Medical Science，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin150040，China)

Objective:To investigate the inhibitory effect and possible mechanism of Gexiazhuyu decoction on hepatic fibrosis induced by porcine serum in rats．Methods:Sixty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups as follows:blank control group，Gexiazhuyu decoction group，porcine serum group，porcine serum plus Gexiazhuyu decoction group．The fibrosis model of rats was achieved by intraperitoneal injection of porcine serum twice weekly for 12 weeks，simultaneously Gexiazhuyu decoction administered daily by gavage for 12 weeks．All rats were sacrificed at the end of experiment，and liver were collected for analysis．The liver histopathology was examined by van Gieson＇s stain，and the content of TGF-β1 in the liver were detected by enzyme linked immunosorbent assay．Real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction was used to analyze α-SMA and TGF-β1 mRNA expression in the liver．Results:Compared with the porcine serum group，the histopathology of rats given Gexiazhuyu decoction improved significantly．α-SMA mRNA expressions were decreased significantly，and TGF-β1 mRNA expressions and content in liver were decreased significantly in porcine serum plus Gexiazhuyu decoction group(P＜ 0.05)．Conclusions:Gexiazhuyu decoction may exert antihepatic fibrosis effect in rats via inhibition of HSC activation

Gexiazhuyu decoction;liver fibrosis;transforming growth factor β1;α-smooth muscle actin

R287．5

B

1006-3250(2012)02-0158-03

黑龍江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(D200820);黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究面上項(xiàng)目(11541344);黑龍江省中醫(yī)藥科研指導(dǎo)項(xiàng)目(ZHY08-W04)

楊 婧(1981-)，女，黑龍江大慶人，講師，醫(yī)學(xué)碩士，從事中醫(yī)藥防治消化系統(tǒng)疾病的基礎(chǔ)研究。

△通訊作者:賈 彥，教授，醫(yī)學(xué)碩士，從事中醫(yī)藥防治肝纖維化的基礎(chǔ)研究，Tel:0451-82195940，E-mail:jy570@sohu．com。

2011-08-12