脾虛發(fā)熱證大鼠模型的研究

劉進(jìn)娜，謝 鳴△，高秀蘭，趙榮華

(1．北京中醫(yī)藥大學(xué)國家重點方劑學(xué)學(xué)科，北京 100029;2．山東省中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，山東 煙臺 264100)

脾虛發(fā)熱證大鼠模型的研究

劉進(jìn)娜1，謝 鳴1△，高秀蘭2，趙榮華1

(1．北京中醫(yī)藥大學(xué)國家重點方劑學(xué)學(xué)科，北京 100029;2．山東省中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，山東 煙臺 264100)

目的:復(fù)制并評價脾虛發(fā)熱大鼠模型。方法:大鼠隨機(jī)分為正常對照組、單純脾虛組、脾虛發(fā)熱組。大鼠采用飲食失節(jié)+過度疲勞法復(fù)制脾虛模型，于造模第22天腹腔注射LPS(80μg/kg)誘導(dǎo)發(fā)熱，測定各時間點的肛溫、體重、外觀行為變化積分值、尿D-木糖排泄率和外周血相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果:①與正常對照組比較，脾虛發(fā)熱組大鼠體溫除在30min有一過性降低外，其余各觀察點均呈顯著性升高(P＜0．01，P＜0．05);單純脾虛組大鼠體溫除在60min時有一過性升高外，其余各點無顯著性差異;脾虛發(fā)熱組與單純脾虛組大鼠在第1、2、3周末的體重均明顯降低;第2、3周末的外觀行為變化總積分值呈顯著性增加(P＜0．05，P＜0.01);第 3 周末的尿 D-木糖排泄率、血 GAS、MTL、IL-1β、IL-2、T3、T4、TSH 均降低，IL-6 和 SS 升高(P ＜0．05，P ＜0．01);②與單純脾虛組相比，脾虛發(fā)熱組大鼠體溫在30min時有一過性降低，之后體溫一直呈顯著性升高(P＜0．01);外周血T4含量顯著性降低(P＜0．01)，其余各指標(biāo)的差異無顯著性。結(jié)論:飲食失節(jié)+過度疲勞+LPS注射可引起大鼠出現(xiàn)類中醫(yī)脾虛發(fā)熱證。

脾虛;脾虛發(fā)熱;證候模型

脾虛發(fā)熱是中醫(yī)脾虛證中的一個特別類型，以脾虛同時伴有發(fā)熱見癥為特點。基于中醫(yī)證候模型復(fù)制的基本要求和中醫(yī)病因及發(fā)病學(xué)理論，本研究擬在以往工作基礎(chǔ)上，參考脾虛發(fā)熱的“氣虛邪郁”機(jī)理，采用“飲食勞倦+過度疲勞法 +LPS注射”方法復(fù)制脾虛發(fā)熱大鼠模型。本文報告了該模型的復(fù)制及其評價。

1 材料

1．1 動物

雄性Wistar鼠200g～220g，購于北京市維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(動物許可證號 SCXK(京)2006～0009)。

1．2 試劑

LPS注射液的制備:脂多糖(Escherichia coli endotoxin 055B5，L2880，LPS)，Sigma 公司生產(chǎn)。無菌條件下，用生理鹽水將 LPS配成濃度為20μg/ml的LPS注射液，備用。D-木糖:Sigma公司生產(chǎn)(生產(chǎn)批號 C5H10O5)。GAS、IL-1β、IL-2、IL-6、T3、T4、TSH、MTL、SS試劑盒由北京華英生物技術(shù)研究所提供(生產(chǎn)批號20101106)。

1．3 儀器

電腦數(shù)字溫度計MC-3B型:OMROM歐姆龍(大連)有限公司生產(chǎn);塑料鋼化筒:執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn):Q/WHC02-2002;r-911全自動放免計數(shù)儀:中國科技大學(xué)實業(yè)總公司生產(chǎn)。

2 方法

2．1 制模方法

采用飲食失節(jié)+過度疲勞復(fù)制脾虛+LPS腹腔注射誘導(dǎo)發(fā)熱［1］的復(fù)合方法。實驗前全部動物進(jìn)行預(yù)游泳篩選，剔除游泳時間少于 10min、大于20min的大鼠。符合上述條件的大鼠每天 PM 2∶00置于盛有溫水 22℃ ±1℃的塑料鋼化桶中游泳10min，每次3只，有抱團(tuán)現(xiàn)象即刻輕輕使之分開;隔日喂食(隔日禁食，隔日足量給食)，連續(xù)3周復(fù)制脾虛模型。于實驗第22天AM 8∶00給予大鼠一次性腹腔注射LPS(80μg/kg)誘導(dǎo)脾虛發(fā)熱。

2．2 分組處理

大鼠隨機(jī)分為正常對照組、單純脾虛組、脾虛發(fā)熱組共3組，每組10只。單純脾虛組和脾虛發(fā)熱組大鼠按上述脾虛證制模方法，連續(xù)3周。正常對照組給予等量生理鹽水。于造模第22天的上午8∶00，脾虛發(fā)熱組大鼠腹腔一次性注射 LPS(80μg/kg)誘發(fā)動物發(fā)熱，單純脾虛和正常對照組大鼠注射等量生理鹽水。

2．3 指標(biāo)測定

實驗期間，每周測量體重和體溫各1次，并觀察記錄其外觀行為變化，統(tǒng)計各組變化分值。第21天各組大鼠灌服10%D-木糖溶液5ml，于代謝籠中收集大鼠5h的尿液，用簡苯三酚法測定 D-木糖排泄率(即尿液中排出的劑量與所灌入胃內(nèi)總劑量的比率)。于造模第22天測定各組大鼠腹腔注射后30min、60min、120min、180min、240min、330min 的肛溫，繪制各組平均體溫曲線。隨后即刻腹腔注射10%水合氯醛(0．35ml/100g體重)麻醉，腹主動脈取血6ml，其中 3ml室溫放置，2500rpm 15min取血清;3mL于管中預(yù)置的10%EDTA·Na230μl和抑肽酶40μl充分混勻，2000rpm 10min取血漿，血清和血漿于冰箱-20℃保存。放免試劑盒法測定 GAS、IL-1β、IL-2、IL-6、T3、T4、TSH 和 MTL、SS。

2．4 統(tǒng)計方法

3 結(jié)果

3．1 各組大鼠的體溫變化

表1圖1顯示，與正常對照組比較，脾虛發(fā)熱組大鼠體溫在30min時有一過性降低，之后體溫顯著升高，其中在 60min、120min、180min、240min 時的差異均有顯著性(P ＜0．01，P ＜0．05);單純脾虛組大鼠的體溫在60min時有一過性升高，差異有非常顯著性(P＜0．01)，之后體溫變化不大，各點體溫差異均無顯著性(P＞0.05)。與單純脾虛組相比，脾虛發(fā)熱組大鼠體溫在30min時有一過性降低，之后體溫明顯升高，其中120min、180min、240min時的差異均有顯著性(P ＜0．01)。

圖1顯示，除正常對照組大鼠于注射后30min時有一過性小幅升高外，其余時間點的體溫變化不大。與正常對照組相比，單純脾虛組大鼠體溫在60min時有一過性升高并出現(xiàn)峰值，之后下降并趨于平穩(wěn)，其60min～180min時段的體溫曲線下移;脾虛發(fā)熱組體溫在30min時一過性下降，之后體溫逐漸升高，180min時出現(xiàn)峰值，之后有所下降，60min～330min時段的體溫曲線上抬。與單純脾虛組相比，脾虛發(fā)熱組大鼠體溫 60min時升高，60min～180min的體溫曲線明顯上抬。

表1 各組大鼠不同時間點的△T變化(±s，n=10)

表1 各組大鼠不同時間點的△T變化(±s，n=10)

注:正常對照組比較:*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01;與單純脾虛組比較:▲▲ P ＜0．01

組 別 例數(shù)不同時間點的△T/min 30 60 120 180 240 330正常對照組 10 0．24 ±0．50 －0．07 ±0．39 0．07 ±0．41 0．19 ±0．390．03 ±0．35 0．00 ± 0．46單純脾虛組 10 －0．08±0．67 0．37±0．20＊＊ －0．19 ±0．27 －0．15±0．34 －0．40±0．45 －0．20±0．44脾虛發(fā)熱組 10 －0．46 ±0．60* 0．56 ±0．24＊＊ 0．38 ±0．47＊▲▲ 1．36 ±0．61＊＊▲▲ 0．49 ±0．27＊＊▲▲0．11 ± 0．37

圖1 各組大鼠不同時間點的△T變化曲線

3．2 各組大鼠體重和外觀表征的變化

3．2．1 體重變化 表2顯示，正常對照組大鼠體重隨時間不斷明顯增加，脾虛發(fā)熱組與單純脾虛組大鼠體重增加較為緩慢，在第3周末均未見增加。與正常對照組比較，脾虛發(fā)熱組與單純脾虛組大鼠在第1、2、3周末的體重均明顯降低，差異均有顯著性(P＜0．05，P＜0.01)。與單純脾虛組相比，脾虛發(fā)熱組大鼠各點的體重?zé)o明顯變化，差異均無顯著性(P ＞0．05)。

3．2．2 行為學(xué)變化 表3顯示，造模1周后各組大鼠外觀行為均未有明顯變化，各組總積分差異均無顯著性(P＞0．05)。較之正常對照組，實驗第2周單純脾虛組和脾虛發(fā)熱組大鼠開始表現(xiàn)出活動減少、喜扎堆、飲食減少、皮毛不順、大便溏薄等;第3周出現(xiàn)動作遲緩、神情怠、毛發(fā)不澤、倦臥等變化，其外觀行為變化總積分均見明顯升高，差異均有顯著性(P＜0．01);單純脾虛組和脾虛發(fā)熱組大鼠外觀行為變化總積分的差異均無顯著性(P＞0．05)。

表2 各組大鼠體重變化(±s，n=10)

表2 各組大鼠體重變化(±s，n=10)

注:與正常對照組比較:*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01

組 別 例數(shù)造模不同時間點的體重(g)0周 1周 2周 3周正常對照組 10 190．96 ±6．87 237．62 ±10．80 288．71 ±12．93 318．04 ±17．16單純脾虛組 10 193．01±7．60 220．07 ± 8．39* 231．30 ± 5．41＊＊ 231．29± 7．96＊＊脾虛發(fā)熱組 10 195．29±7．08 220．97 ± 8．38* 227．30 ± 5．42＊＊ 228．23± 6．49＊＊

表3 各組大鼠不同時間點外觀行為總積分(±s，n=10)

表3 各組大鼠不同時間點外觀行為總積分(±s，n=10)

注:與正常對照組比較:＊＊P ＜0．01

組 別 外觀行為變化總積分第1周末 第2周末 第3周末正常對照組0．18 ± 0．07 0．20 ±0．13 0．21 ±0．15單純脾虛組 0．33 ±0．25 1．15 ±0．50＊＊ 1．45 ±0．65＊＊脾虛發(fā)熱組 0．31 ±0．20 1．10 ±0．45＊＊ 1．35 ±0．39＊＊

3．3 各組大鼠與脾虛相關(guān)指標(biāo)的變化

3．3．1 尿 D-木糖排泄率的變化 表4顯示，與正常對照組相比，單純脾虛組和脾虛發(fā)熱組大鼠尿D-木糖排泄率均降低，差異有顯著性(P＜0．05，P＜0．01)。與單純脾虛組相比，脾虛發(fā)熱組大鼠尿D-木糖排泄率無明顯變化(P＞0.05)。

3．3．2 血中胃腸激素含量的變化 表5顯示，與正常對照組相比，單純脾虛組和脾虛發(fā)熱組大鼠外周血GAS、MTL含量均明顯降低，SS含量升高，差異均有顯著性(P＜0．01，P＜0.05)。與單純脾虛組相比，脾虛發(fā)熱組大鼠外周血 GAS、MTL和SS含量均無明顯變化(P＞0.05)。

3．3．3 血中代謝調(diào)節(jié)激素的變化 表6顯示，與正常對照組相比，單純脾虛組和脾虛發(fā)熱組大鼠外周血T3、T4、TSH含量均見降低，差異均有顯著性(P＜0．01)。與單純脾虛組相比，脾虛發(fā)熱組大鼠外周血T3、TSH含量無明顯差異(P＞0.05)，但 T4含量降低，差異有顯著性(P＜0．01)。

3．3．4 血中免疫因子的變化 表7顯示，與正常對照組相比，單純脾虛組和脾虛發(fā)熱組大鼠外周血IL-1β、IL-2含量降低，血 IL-6含量升高，差異均有顯著性(P＜0.05，P＜0．01)。與單純脾虛組相比，脾虛發(fā)熱組大鼠外周血 IL-1β、IL-2和IL-6含量均無明顯差異(P＞0.05)。

表4 各組大鼠尿D－木糖排泄率的變化(±s)

表4 各組大鼠尿D－木糖排泄率的變化(±s)

注:與正常對照組比較:*P ＜0.05，＊＊P ＜0．01

組 別 例數(shù) D 木糖排泄率正常對照組10 23．84 ± 0．50單純脾虛組 10 19．65 ±4．18＊＊脾虛發(fā)熱組 10 20．22 ±5．42*

4 討論

脾虛發(fā)熱是中醫(yī)脾虛證中的一個特別證型，有關(guān)該模型復(fù)制的研究比較少。之前，張麗萍等［2、3］采用饑餓法(動物禁食7d)造成兔氣虛模型，再給予耳緣靜脈注射傷寒、副傷寒三聯(lián)疫苗0．5ml/kg誘導(dǎo)氣虛發(fā)熱模型，并觀察到補中益氣湯不同劑量及其拆方對該模型均有不同的退熱作用。劉瑜彬等［4］以大鼠ΔT和體重為觀察指標(biāo)，采用游泳勞損 +食量限制+注射LPS復(fù)制大鼠氣虛發(fā)熱模型，并觀察了補中益氣湯高、中、低劑量對模型體溫的影響。這兩篇報道均以發(fā)熱為重點，對模型涉及脾虛的特性僅限于動物一般外觀行為上的描述，缺乏實驗室相關(guān)指標(biāo)的支持，作為脾虛或氣虛發(fā)熱的模型仍有待評價。

表5 各組大鼠外周血中胃腸激素的變化(±s)

表5 各組大鼠外周血中胃腸激素的變化(±s)

注:與正常對照組比較:*P ＜0.05，＊＊P ＜0．01

組 別 例數(shù) 外周血中的胃腸激素含量GAS(pg/ml) MTL(pg/ml) SS(pg/ml)正常對照組9 69．57 ±13．78 438．17 ±52．26 231．72 ± 9．95單純脾虛組 9 55．84 ± 7．85＊＊ 384．44 ±23．41* 265．34 ±37．61*脾虛發(fā)熱組 9 55．44 ± 6．91＊＊ 359．27 ±33．00＊＊ 260．23 ±41．11*

表6 各組大鼠外周血相關(guān)物質(zhì)代謝指標(biāo)的變化

表7 各組大鼠外周血中免疫因子的變化(±s)

表7 各組大鼠外周血中免疫因子的變化(±s)

注:與正常對照組比較:*P ＜0.05，＊＊P ＜0．01

組 別 例數(shù) 外周血中的相關(guān)介質(zhì)IL-1β(pg/ml) IL-2(pg/ml) IL-6(pg/ml)正常對照組9 0．69 ± 0．05 7．43 ± 1．83 153．05 ± 41．57單純脾虛組 9 0．23 ±0．02* 5．60 ±1．65* 200．96 ±62．95*脾虛發(fā)熱組 9 0．29 ±0．02* 5．40 ±0．82＊＊ 228．64 ±28．60＊＊

之前本學(xué)科曾根據(jù)中醫(yī)“饑飽失常、腸胃乃傷”和“勞則傷脾”的中醫(yī)發(fā)病學(xué)理論，采用飲食失節(jié)+過度疲勞法，成功復(fù)制出脾虛證大鼠模型［5］。在探討小柴胡湯及其不同配伍與效用關(guān)系的研究中，曾應(yīng)用小劑量LPS腹腔注射成功誘導(dǎo)出大鼠發(fā)熱模型［6、7］。本次則根據(jù)中醫(yī)脾虛發(fā)熱證的脾虛 +發(fā)熱的臨床特征，結(jié)合有關(guān)脾虛發(fā)熱機(jī)制認(rèn)識中的“氣虛邪郁”［8］以及 LPS作為外源性致熱源的特性，提出“飲食失節(jié) +過度疲勞 +外邪復(fù)感”的脾虛發(fā)熱機(jī)制，采用“間隔斷食+游泳疲勞 +腹注 LPS”的方法來復(fù)制脾虛發(fā)熱模型。

目前中醫(yī)脾虛證模型復(fù)制的方法較多，但有關(guān)模型的評價學(xué)界尚未有公認(rèn)統(tǒng)一的評判標(biāo)準(zhǔn)。通常，如能同時滿足在模型復(fù)制思路或方法上盡可能符合中醫(yī)病因及發(fā)病學(xué)經(jīng)驗、模型動物比較好地表現(xiàn)出類似中醫(yī)臨床癥狀、出現(xiàn)與中醫(yī)證密切相關(guān)的現(xiàn)代生理病理改變(相關(guān)實驗室指標(biāo))這樣一些條件應(yīng)該是可以得到多數(shù)人認(rèn)同的。基于這種考慮，本模型復(fù)制研究中設(shè)立了包括體重變化在內(nèi)的外觀表征、與脾虛相關(guān)的實驗室指標(biāo)及發(fā)熱等多組指標(biāo)群以能全面評估模型的系統(tǒng)特征。其中對與中醫(yī)癥征密切相關(guān)的動物外觀行為的觀察，在以往定性描述的基礎(chǔ)上，引入各行為分值及表征變化總積分值的半定量方法來提高判斷的客觀準(zhǔn)確性。實驗室指標(biāo)的選定則是根據(jù)中醫(yī)脾主運化、為氣血生化之源及氣主衛(wèi)外功能，參考了目前有關(guān)脾虛現(xiàn)代研究的部分成果，如與脾虛相關(guān)的胃腸功能(血GAS、MTL和 SS 及尿 D-木糖排泄率)［9、10］、物質(zhì)代謝(血 T3、T4、TSH)［11、12］及 免 疫 功 能 (血 IL-1β、IL-2、IL-6)［13、14］等多組指標(biāo)以作為該模型評定的佐證。

本實驗觀察到，單純脾虛組和脾虛發(fā)熱組大鼠于實驗第2周開始表現(xiàn)出活動減少、喜扎堆、飲少便溏、皮毛不順澤等外觀變化，實驗第3周進(jìn)一步出現(xiàn)明顯的動作遲緩、倦怠倦臥、毛發(fā)不澤等表現(xiàn)，外觀行為變化積分值和體重分別出現(xiàn)明顯的升高和降低。同時反映胃腸功能的血GAS、MTL和尿D-木糖排泄率明顯降低;反映機(jī)體代謝水平的血 T3、T4及TSH含量以及反映免疫(防御)功能狀態(tài)的血 IL-1β、IL-2含量均見降低，與之前的研究結(jié)果［6］相一致。結(jié)果再次表明，采用飲食不節(jié)加游泳疲勞的方法可以穩(wěn)定誘導(dǎo)出大鼠的中醫(yī)脾虛證。實驗還觀察到，單純脾虛模組大鼠按80μg/kg劑量一次性腹腔注射LPS 30min后出現(xiàn)體溫升高，持續(xù)升高的體溫超過6h。綜合大鼠外觀行為、脾虛相關(guān)實驗室指標(biāo)及發(fā)熱等多組指標(biāo)的變化，可以判斷該模型大鼠的確具有中醫(yī)脾虛發(fā)熱證的特征。結(jié)論為采用飲食不節(jié)+游泳疲勞與注射LPS方法可誘導(dǎo)出大鼠脾虛發(fā)熱證模型。

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Research on the rat model of fever due to spleen deficiency syndrome

LIU Jin-na1，XIE Ming1△，GAO Xiu-lan2，ZHAO Rong-hua1
(1．Formulary Department，the national key discipline，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing100029，China;2．Shandong College of Traditional Chinese Medicine，Yantai246100，China)

Objective:To copy and value the model of spleen-qi deficiency with fever．Methods:The rats were assigned into the normal group，spleen-deficiency group，spleen-deficiency with fever group．The rats were treated with excess fatigueout of constant diet to copy spleen-qi deficiency rat model．On the 22th day，The rats of spleen-qi deficiency with fever group were respectivelyipwith LPS(80μg/kg)to induce fever．The rectal temperature was measured．The body weight and change of syndrome and autonomous behavior was observed．D-xylose of urine and peripheral blood GAS，MTL，SS，IL-1β，IL-2，IL-6，T3，T4，TSH are measured．Result:①Compared with the normal group，the rectal temperature of spleen-qi deficiency with fever group has a transient decrease at 30min，then raised obviously(P＜ 0．05，P＜0．01);the spleen-qi deficiency group has a transient decrease at 60min，then return to the basic line．The body weight of spleen-qi deficiency and spleen-qi deficiency with fever group were decreased obviously at the end of 3w(P＜0．01)and the integral quantity of appearance behavior change were significantly increased at the weekend of 2w and 3w(P＜0．05，P＜0．01);Urine D-xylose excretion rate，peripheral blood GAS，MTL，IL-1β，IL-2，T3，T4，TSH decreased and IL-6，SS increased(P＜ 0．05，P＜0．01)．②Compared with the spleen-qi deficiency group，temperature of spleen-qi deficiency with fever group has a transient decrease at 30min，then raised obviously(P＜0．01)．Blood T4has decreased obviously(P＜0．01)，other indexes have no significance．Conclusion:By adopting excess fatigue+out of constant diet+LPS injection had induced the rats show a serial of appearance in syndrome model of autonomous behavior，body weight，body temperature which were similar to Chinese symptoms of spleen-qi deficiency with fever．

Spleen-qi deficiency;Spleen-qi deficiency with fever;Syndrome model

R332

B

1006-3250(2012)02-0150-04

劉進(jìn)娜(1983-)，女，河北邢臺人，醫(yī)學(xué)碩士，從事方-證相關(guān)的研究。

△通訊作者:謝 鳴(1957-)，男，安徽安慶人，教授，博士研究生導(dǎo)師，醫(yī)學(xué)博士，從事方-證相關(guān)研究，Tel:01064286992，E-mail:xieming603@263．net。

2011-09-08