慢性乙型肝炎患者肝組織中HBV cccDNA定量檢測與基因型的相關(guān)性分析

蔡偉雄 李惠平 何少雄 何偉彬

1.廣東省博羅縣人民醫(yī)院檢驗科，廣東博羅 516100；2.廣東省博羅縣人民醫(yī)院感染科，廣東博羅 516100

目前全世界受HBV感染者接近20億，其中有超過3億的慢性感染者。在亞太地區(qū)，慢性HBV感染率超過10%，其中25%～40%的患者會因合并或不合并肝細胞癌的肝硬化而死亡。世界衛(wèi)生組織已將HBV感染列為全球十大死亡原因之一[1-3]。目前已建立對HBsAg、HBcAg及HBeAg及其抗體系統(tǒng)的檢測法。三種抗原體系統(tǒng)中以檢測HBsAg最為常用[4]。

為了進一步探明博羅地區(qū)慢性乙型肝炎感染者的基因型及其通過分子生物學(xué)來判斷他們的病情輕重，筆者取患者的血清進行了基因型的檢測及共價閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）的定量測定工作，并通過統(tǒng)計軟件對二者的相關(guān)性進行統(tǒng)計學(xué)分析，以期為慢性乙型肝炎患者的診斷和治療提供參考和幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料

筆者對廣東博羅地區(qū)2010年5月～2011年10月305例慢性乙型肝炎（CHB）患者行肝組織HBV cccDNA定量檢測。通過數(shù)據(jù)分析，探討患者肝組織中HBV cccDNA含量與患者的基因型的相關(guān)性，為臨床診斷和治療提供科學(xué)參考。所選患者當(dāng)中，男242例，女63例；年齡15～54歲，平均（34.8±4.6）歲。以上患者院外半年內(nèi)均未行接受任何形式的抗病毒治療。將305例慢性乙型肝炎患者中隨機分為4組，即：A組95例，B基因型69例占72.6%，療程6個月，隨訪6個月；B組84例，B基因型62例占73.8%，療程9～30個月，平均（17.5±4.1）個月；C組77例，B基因型51例占66.2%，療程8個月，隨訪6個月；D組49例，B基因型38例占77.6%，療程9～24個月，平均（16.9±4.7）個月。各組慢性乙型肝炎患者的基本資料見表1。統(tǒng)計分析表明，表中多個樣本方差分析得4組的男女比例、年齡、HBV-DNA水平、基因型、基因亞型差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 檢查與治療方法

305例患者中，e抗原陽性的慢性乙型肝炎患者249病例，其中236例采用PCR-RFLP的方法測出基因型，另外13例擴增HBV S區(qū)直接測序，經(jīng)Pubmed BLAST比對得出HBV基因型、基因亞型。在已確定基因型的基礎(chǔ)上再進一步用PCR-RFLP法分基因亞型。249例慢性乙型肝炎患者中HBV B基因型172例占69.07%，C基因型77例占30.92%，未發(fā)現(xiàn)其他的基因型。B基因型中除一例沒有測出亞型，余均為Ba亞型，未見Bj亞型；C基因型中一個為C1和C2的混合亞型，余均為C2亞型。

HBV-DNA基因分型檢測也可以用ELISA法得以實現(xiàn)，主要是采用第一軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部生物醫(yī)學(xué)診斷研究中心HBV基因分型微板核酸雜交試劑盒，對HBV2DNA定性檢測陽性標(biāo)本進行基因分型。（1）取處理液100μL于0.5 mL離心管內(nèi)，加待測血清 100μL，混勻，100℃煮沸 15 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液12μL于反應(yīng)液管內(nèi)，彈勻，10 000 r/min離心10 s，上機，預(yù)變性94℃ 2 min；循環(huán)條件：94℃ 50 s，55℃ 50 s，72℃ 65 s，共循環(huán) 38 次，最后 72℃延伸 3 min（陰性、陽性參照同標(biāo)本處理）。（2）取擴增產(chǎn)物變性，98℃ 10 min，迅速冰浴10 min。各取雜交液90μL、已變性產(chǎn)物20μL、各型核酸探針25μL分別加入反應(yīng)孔內(nèi)，同時設(shè)空白對照（只加4滴雜交液及顯色探針25μL），輕輕搖動混勻，50℃水浴60 min，輕輕倒凈液體。（3）于每孔中加入雜交洗液200μL，50℃ 3～5 min，輕輕倒凈再重復(fù)洗2次。（4）每孔加顯色劑A、B各1滴，避光，置37℃ 10 min后加入終止液2滴，結(jié)果判定按P/N值（標(biāo)本OD值/陰性參照OD值）＜3.0為陰性，P/N值≥3.0為陽性。常規(guī)肝穿刺取得肝組織，部分組織條放入高壓滅菌EP管內(nèi)，立即放入-70℃的冰箱內(nèi)保存。采用ligh tcycler核酸擴增儀行肝組織HBV cccDNA及肝組織HBV-DNA和血清HBV-DNA定量測定。HBV cccDNA檢測采用紹俊彬等設(shè)計的巢式PCR法。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內(nèi)比較采用配對t檢驗，計數(shù)資料采用x2檢驗，以α=0.05為作為檢驗的顯著性水平,計量資料兩指標(biāo)間的相關(guān)性符合雙變量正態(tài)分布，用直線相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

表1 不同組慢性乙型肝炎患者HBV基因型和HBV cccDNA含量檢測結(jié)果相關(guān)性分析

對以上4組患者的HBV基因型和HBV cccDNA含量極性統(tǒng)計分析表明，二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），即表明慢性乙型肝炎患的HBV基因型和HBV cccDNA含量的高低比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

乙型肝炎是病毒性肝炎中最常見，危害程度最大的一種。乙型肝炎病毒感染仍是威脅著人民健康的全球性問題。以放射免疫法及酶聯(lián)免疫法及酶聯(lián)免疫法最為敏感，其次為反向被動血凝及免疫粘附血凝法。免疫擴散與對流電泳法雖不甚敏感，但仍為我國廣泛采用。研究表明，慢性乙型肝炎患者患者血清中出現(xiàn)cccDNA是肝臟損害的標(biāo)志，可以反應(yīng)病情的輕重及病情的進展，同時也反應(yīng)了實時熒光定量PCR法檢測CHB患者血清HBV cccDNA靈敏性較高、特異性強，可以應(yīng)用于臨床來監(jiān)測乙型肝炎患者血清中cccDNA的水平及動態(tài)變化。HBV cccDNA含量是乙型肝炎病毒復(fù)制最特異的指標(biāo)，其靈敏性和準(zhǔn)確性都要超過目前常用的HBVDNA檢測。

乙型肝炎病毒是一種DNA病毒，HBV的形態(tài)分3種[5]。第1種類似于大球形顆粒，也稱Dane顆粒。Dane顆粒的中心部位就是環(huán)狀并且有缺口的DNA雙鏈，和依附在上面的DNA聚合酶。乙型肝炎病毒的基因組最引人注目的一個特征就是它非常小，其DNA分子大約含有約3 200個核苷酸，比已知的最大的病毒基因組小幾百倍，和人類擁有的基因組相比較，僅僅是百萬分之一。而且乙型肝炎病毒DNA的兩鏈長短不一，長鏈完整，長度恒定，為負鏈。短鏈?zhǔn)钦?，長度可變，大概是長鏈的50%～80%。表面抗原和核心抗原都是由Dane顆粒的DNA編碼而來。

HBV基因組雖為雙鏈環(huán)形DNA，但其復(fù)制過程有RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒的特性，需要逆轉(zhuǎn)錄酶活性產(chǎn)生RNA/DNA中間體，再繼續(xù)進行復(fù)制。其過程為：（1）在由病毒和（或）細胞來源的DNA-p作用下，正鏈?zhǔn)紫妊由煨纬晒矁r閉合環(huán)狀DNA。（2）以此為模板，通過宿主肝細胞酶的作用轉(zhuǎn)錄成復(fù)制中間體。（3）再以此為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄酶的作用，形成第一代和第二代DNA。此雙鏈DNA部分環(huán)化，即完成HBV-DNA的復(fù)制。HBV突變株研究。由于HBV復(fù)制方式有其特殊性，即mRNA中間體進行逆轉(zhuǎn)錄過程中，由于缺乏校對酶（proofreading engymes）易發(fā)生HBV-DNA序列內(nèi)變異。（1）S區(qū)基因突變導(dǎo)致HBsAg亞型改變及血清HBsAg陰性、HBV-DNA陽性乙型肝炎，使臨床診斷困難。一些人接種乙型疫苗后產(chǎn)生抗-HBs，但仍可被HBV的S區(qū)基因突變株感染，而逃避宿主的免疫反應(yīng)。（2）前C基因區(qū)突變與HBV感染后免疫及重型肝炎發(fā)病有關(guān)。一般認為乙型肝炎患者HBeAg轉(zhuǎn)陰，抗-HBe轉(zhuǎn)陽，表示HBV復(fù)制活躍程度減弱，臨床癥狀好轉(zhuǎn)。然而，一些患者當(dāng)HBeAg轉(zhuǎn)陰后，仍有病毒復(fù)制及病情進行性發(fā)展，其血清中除檢出HBsAg和抗-HBe外，還可檢出HBV-DNA、抗-HBcIgM，肝內(nèi)HBcAg陽性，排除其他致肝損害的原因，提示病情變化與HBV有關(guān)。其特點為不易自然緩解，常發(fā)展為肝硬化，抗病毒治療反應(yīng)差。經(jīng)研究表明，此類患者系感染了前C基因突變HBV突變株。（3）P區(qū)基因突變可致HBV復(fù)制減弱或停止。（4）X區(qū)基因突變可使HBxAg合成障礙。

現(xiàn)發(fā)現(xiàn)HBVA、B、C、D基因型可分為5種基因亞型，F(xiàn)基因型可細分為4種基因亞型，還有許多其他的基因亞型與重組型在不斷發(fā)現(xiàn)中。大量的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)HBV基因型、基因亞型的分布具有明顯地域性。我國乙型肝炎病毒主要以B、C基因型為主，另外有少量的A、D基因型分布，南方以B基因型多見，主要為Ba亞型；北方以C基因型多見，主要為C2亞型[6-8]。

乙型肝炎病毒具有高復(fù)制、高突變的特征，多年的自發(fā)突變導(dǎo)致形成多種基因型。本研究表明，慢性乙型肝炎患者HBV基因型和HBV cccDNA含量的高低差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。當(dāng)全基因組核苷酸序列的差異超過8%時，被定義為一個基因型，應(yīng)用該分型標(biāo)準(zhǔn)將HBV 分為A～H 8 種基因型。乙型肝炎病毒基因型間存在發(fā)病機制、療效反應(yīng)和預(yù)后的差異，對乙型肝炎病毒感染者HBV基因分型有助于流行病學(xué)分析、臨床治療和預(yù)后判斷。

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