毛細辛提取物體外抗氧化活性研究

何全磊，苗芳，李春玲

（西北農(nóng)林科技大學生命學院，陜西 楊凌712100）

生物體內(nèi)的自由基主要包括O2－·，·OH，以及H2O2等［1］，它們參與細胞調(diào)節(jié)和信號轉(zhuǎn)導等活動［2］，但也會破壞體內(nèi)的大分子如DNA，蛋白質(zhì)和脂類［3］，同時還與衰老，癌癥等疾病有關(guān)［4］，生物體內(nèi)也有一系列的酶和小分子防御系統(tǒng)［5－7］，但在病理情況下，自由基的清除無效仍決定細胞尤其是細胞膜的損傷程度［8，9］?？寡趸镔|(zhì)可以通過一系列途徑清除自由基［10］，因而顯得尤其重要。人工合成的抗氧化劑如丁基羥基茴香醚（butyl hydroxy anisd，BHA）、2，6－二叔丁基－4－甲基苯酚（2，6－di－tert－butyl－4－methylp－h(huán)enol，BHT）等有一定的副作用，因此尋找天然抗氧化物質(zhì)成為研究的熱點。

毛細辛（Asarum himalaicum）是馬兜鈴科（Aristolochiaceae）細辛屬（Asarum）植物［11］，為傳統(tǒng)中藥，有發(fā)表散寒，鎮(zhèn)咳，止痛，祛痰功效，還可以提取芳香油。

以往對于毛細辛的研究主要集中在揮發(fā)油部分，據(jù)羅文蓉和牛永紅［12］報道，毛細辛中揮發(fā)油含量僅為0.5%，且揮發(fā)油成分中甲基丁香酚（methyleugenol）、欖香脂素（elemicin）、黃樟醚（safrole）為各種細辛所共有，其中以欖香脂素為最多。毛細辛揮發(fā)油成分的藥理作用以鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、解熱及局麻作用為主［13］，目前為止，未見關(guān)于毛細辛揮發(fā)油成分抗氧化功能的報道。對于非揮發(fā)油部分的成分及抗氧化能力研究報道也很少。謝百波等［14］利用溶劑提取、色譜技術(shù)等手段從毛細辛全草中提取鑒定了15個化合物，所有化合物均首次從毛細辛中分離得到，其中幾個化合物有很強的抗氧化活性。

通過50%乙醇粗提和不同極性溶劑萃取的方法對毛細辛全草進行提取分離，采用多種抗氧化活性檢測方法綜合評價不同溶劑提取物的抗氧化能力，為毛細辛作為天然抗氧化劑的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品的采集與制備 毛細辛全草于2010年6月采自秦嶺南坡寧陜縣境內(nèi)的平和梁，自然陰干后粉碎成細末，裝瓶備用。

實驗的主要提取分離和抗氧化活性測定工作在2011年5－7月間完成，不同濃度提取物的處理均重復3次。

1.1.2 主 要 試 劑 2，6－二 叔 丁 基－4－甲 基 苯 酚 （2，6－di－tert－butyl－4－methylp－h(huán)enol，BHT）、吩 嗪 硫 酸 甲 酯（phenazlne methosulfate）、鄰二氮菲（1，10－phenanthrollne）從上海阿拉丁試劑有限公司購買；還原型輔酶I二鈉（NADH I Na2）購自北京索萊寶科技有限公司；1，1－二苯基－2－苦苯肼自由基（1，1－diphenyl－2－plcrylhydrazyl radical，DPPH·）購自美國Sigma公司；氯化硝基四氮唑藍（nitrotetrazolium blue chloride，NBT）購于國藥集團化學試劑有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 提取物制備

準確稱取毛細辛粉末80g，置于索氏提取器中，以50%的乙醇、料液比為1∶12（g／mL）進行回流提取2h，提取3次，合并提取液，過濾，減壓濃縮得到乙醇浸膏［15］。稱量浸膏干重，然后將浸膏轉(zhuǎn)入分液漏斗中，加200mL蒸餾水制成懸浮液。依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，每級重復3次。最后得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水提取物。

1.3 提取物抗氧化活性的測定

分別將毛細辛4種溶劑提取物（石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提物）溶于體積分數(shù)為50%的乙醇中，配制成質(zhì)量濃度為0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0mg／mL的溶液（具體濃度根據(jù)試驗預試調(diào)整），同樣也將BHT配制成以上對應(yīng)濃度梯度的溶液。

DPPH· 清除能力測定參考Sarikurkcu等［16］的方法；·OH清除能力的測定參照 Wei等［17］的方法并稍作改動，將試驗中用到的H2O2體積分數(shù)改為0.1%，鄰二氮菲和FeSO4的濃度改為7.5mmol／L；O2－·清除能力的測定采用Ozsoy等［18］的方法，提取物對金屬離子的螯合能力測定參照Gül9in和Berashvili［19］的方法。提取物對自由基的清除能力用清除率和IC50值表示。其中提取物對DPPH·、O2－·的清除和對金屬離子的螯合均適用如下公式：清除率（或螯合率）＝［（A0－A1）／A0］×100%；其中，A0為陰性對照（用溶劑代替待測樣品）在特定波長下的吸光度，A1為待測樣品在特定波長下的吸光度；·OH的清除率公式為：清除率＝［（As－Ap）／（Ab－Ap）］×100%；其中，As為待測樣品在536nm波長下的吸光度，Ap為用溶劑代替待測樣品在536nm波長下的吸光度，Ab為用溶劑代替待測樣品和H2O2時在536nm波長下的吸光度。

IC50值是清除率（或螯合率）為50%時的樣品質(zhì)量濃度。IC50值越大，表明該提取物清除自由基能力（或螯合金屬離子能力）越弱，IC50值越小，表明該提取物清除自由基能力（或螯合金屬離子能力）越強。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有測試重復3次，數(shù)據(jù)以“平均值±標準偏差（－x±s）”表示，采用Origin 8.5及Excel對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛細辛不同溶劑提取物清除DPPH·活性

DPPH·是一種非常穩(wěn)定的合成自由基，可以從黃酮類化合物中吸收質(zhì)子變成黃色，進而通過吸光值的變化反映樣品對自由基的清除能力。黃酮類化合物的抗氧化活性與其清除DPPH·的能力呈正相關(guān)［20］。

毛細辛乙酸乙酯、正丁醇、水和石油醚提取物均具有清除DPPH·的能力（圖1），4種提取物相比，乙酸乙酯和正丁醇提取物清除DPPH·的能力較強，而石油醚提取物清除DPPH·的能力最弱。乙酸乙酯、正丁醇、水和石油醚提取物清除DPPH·的IC50值分別為0.376，0.422，1.294和2 334.231mg／mL，均小于陽性對照BHT的IC50值（0.312mg／mL）。根據(jù)IC50值的大小，毛細辛4種溶劑提取物和對照BHT清除DPPH·的能力大小順序為：BHT＞乙酸乙酯提取物＞正丁醇提取物＞水提取物＞石油醚提取物。

2.2 毛細辛不同溶劑提取物清除·OH活性

·OH是已知最強的氧化劑，幾乎可以與所有細胞成分發(fā)生反應(yīng)，對生物體危害極大［21］。通過Fenton反應(yīng)體系產(chǎn)生·OH，進而可以測定各提取液對它的清除能力。

毛細辛4種溶劑提取物均具有清除·OH的能力（圖2），且隨著提取物濃度的升高，清除·OH的能力增強。毛細辛正丁醇、乙酸乙酯、石油醚和水提取物以及對照BHT的IC50值分別為0.776，0.781，2.082，4.325和0.266 mg／mL，依據(jù)IC50值的大小，毛細辛4種溶劑提取物和對照BHT清除·OH的能力大小順序依次為：BHT＞正丁醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞石油醚提取物＞水提取物。正丁醇和乙酸乙酯提取物清除·OH的能力比較接近，而水提取物對·OH的清除能力最弱。

2.3 毛細辛不同溶劑提取物清除O2－·的活性

超氧陰離子自由基（O2－·）是分子氧的單電子還原產(chǎn)物，極不穩(wěn)定，具有高的反應(yīng)活性，在食品、化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域都受到廣泛關(guān)注。本實驗采用硝基四氮唑藍還原法，通過檢測吸光度的變化確定提取物清除O2－·的能力大小。

毛細辛乙酸乙酯、正丁醇、水和石油醚提取物均具有清除O2－·的能力（圖3），并且清除能力與提取物濃度呈量效關(guān)系。毛細辛乙酸乙酯、正丁醇、水和石油醚提取物的IC50分別為0.297，0.365，0.988和3.965mg／mL，依據(jù)IC50值大小，毛細辛4種溶劑提取物清除O2－·的能力大小順序為乙酸乙酯提取物＞正丁醇提取物＞水提取物＞石油醚提取物。毛細辛乙酸乙酯提取物清除O2－·的能力與對照BHT比較接近，它們的IC50值分別為0.297和0.296mg／mL。

圖1 毛細辛不同溶劑提取物清除DPPH·的活性Fig.1 The DPPH·scavenging activity of different solvent extracts of A.himalaicum

圖2 毛細辛不同溶劑提取物對·OH清除活性Fig.2 The hydroxyl free radical scavenging activity of different solvent extracts of A.himalaicum

2.4 毛細辛不同溶劑提取物對金屬離子的螯合活性

很多金屬離子在生物體內(nèi)作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)催化酶的活性部位，對這些離子的螯合作用在一定程度上可以降低體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。因而提取物對金屬離子的螯合能力從另一方面反映了它的抗氧化能力。

毛細辛4種溶劑提取物均對金屬離子有螯合作用，而且水提取物具有較高的金屬離子螯合能力，遠遠超過對照BHT對金屬離子的螯合能力（圖4）。毛細辛水、乙酸乙酯、正丁醇和石油醚提取物對金屬離子螯合能力的IC50值分別為0.026，0.528，0.805和26.050mg／mL，BHT的IC50值為0.373mg／mL。依據(jù)IC50值的大小，毛細辛4種溶劑提取物和對照BHT對金屬離子的螯合能力大小順序依次為：水提取物＞BHT＞乙酸乙酯提取物＞正丁醇提取物＞石油醚提取物。

3 結(jié)論與討論

黃酮類化合物是目前研究最多的一類抗氧化物，它們多具有酚羥基，易溶于水、甲醇、乙醇等極性強的溶劑，且多與糖類形成黃酮苷類物質(zhì)。按照劉璐等［22］的方法，測得毛細辛提取物的總黃酮含量為6.43%。馮濤和莊海寧［23］研究表明：有游離3－OH 、5，7－間－二羥基，3’，4’－兒茶素（二羥基）、2－3雙鍵、4－氧代基團的黃酮類化合物要比其相應(yīng)沒有這些結(jié)構(gòu)特征的化合物的抗氧化活性強，糖苷類取代基會降低黃酮類化合物的抗氧化活性。謝百波等［14］從毛細辛中分離鑒定的15種化合物，其中（2S）－柚皮素－5，7－二－O－β－D－吡喃葡萄糖苷 （2S－naringenin 5，7－di－O－β－D－pyranosylglucoside）屬于黃酮類化合物，該化合物有4’－OH 且5－和7－位被吡喃葡萄糖基取代，因而具有一定的抗氧化活性。據(jù)該文獻報道，毛細辛乙酸乙酯部分含有6個馬兜鈴酸衍生物，4－羥基苯甲酸（4－h(huán)ydroxybenzoic acid）、3，4－二 羥 基 苯 甲 酸 （3，4－dihydroxybenzoic acid）和 4－羥 基 肉 桂 酸 （4－h(huán)ydroxycinnamic acid）。譚榀新等［24］研究表明：酚酸類物質(zhì)中的羥基苯甲酸及其衍生物、羥基肉桂酸（羥基苯丙烯酸）及其衍生物均具有較強的抗氧化活性，其活性與酚羥基有關(guān)。毛細辛正丁醇部分所含的化合物是（2S）－柚皮素－5，7－二－O－β－D－吡喃葡萄糖苷，屬于黃酮類物質(zhì)，具有較強的抗氧化活性。本研究表明，毛細辛全草的乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物均對DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基具有較強的清除能力，根據(jù)以上文獻資料可以推斷，毛細辛全草乙酸乙酯提取物的抗氧化活性與4－羥基苯甲酸、3，4－二羥基苯甲酸和4－羥基肉桂酸有關(guān)，而毛細辛全草正丁醇提取物的抗氧化活性與（2S）－柚皮素－5，7－二－O－β－D－吡喃葡萄糖苷有關(guān)。

圖3 毛細辛不同溶劑提取物對O2－·的清除活性Fig.3 The superoxide anion free radical scavenging activity of different solvent extracts of A.himalaicum

圖4 毛細辛不同溶劑提取物金屬離子螯合能力Fig.4 The metal ion chelating power of different solvent extracts of A.himalaicum

毛細辛在陜西和甘肅等地作為藥物細辛使用，國內(nèi)外對其研究較少，但細辛屬植物在含有的天然產(chǎn)物成分和化學性質(zhì)方面都有很多的相似性。如謝百波等［14］的研究發(fā)現(xiàn)馬兜鈴內(nèi)酰胺I（aristololactam I）和（2S）－柚皮素－5，7－二－O－β－D－吡喃葡萄糖苷在多種細辛屬植物 （A.longerhizomatosum的根莖和根、A.maximum的根、A.ichangense以及A.canadense全草）中均有發(fā)現(xiàn)，故認為這兩個成分很可能是該屬植物的共有成分。

毛細辛及其他細辛屬植物在揮發(fā)油組成和非揮發(fā)性成分上都很相似，所以它們的藥理作用也很相似。通過分析國內(nèi)外對其他細辛的研究就可以對毛細辛藥用價值有所了解。

Dan等［25］的研究發(fā)現(xiàn)北細辛（A.heterotropoidesvar.mandshuricum）的揮發(fā)油對5種植物病原菌有光譜抗菌效果，尤其對惡疫霉（phytophthora cactorum）有最佳殺滅效果，揮發(fā)油中發(fā)揮生物活性的主要是甲基丁香酚（約占揮發(fā)油質(zhì)量的59.42%）。毛細辛的揮發(fā)油含量約為北細辛的1／5［26］，且扈成浩等［27］的實驗發(fā)現(xiàn)毛細辛揮發(fā)油主要成分與北細辛相近，而以欖香脂素為主，那么可以推知毛細辛揮發(fā)油對植物病原菌也應(yīng)有抗菌效果，只是可能稍弱，具體的結(jié)果仍需要實驗支持。

Cai等［28］的研究發(fā)現(xiàn)，毛細辛、青城細辛（A.splendens）和皺花細辛（A.crispulatum）95%的乙醇提取物或水提物對4種腫瘤細胞株（HL－60，BGC－823，KB和Bel－7402）中的一或兩種有選擇性的細胞毒活性，這為開發(fā)毛細辛的抗腫瘤藥性提供了指導。

前文已提到毛細辛具有鎮(zhèn)痛、解熱等藥理作用，但是其作用的機理尚不清除。Kim等［29］研究發(fā)現(xiàn)華細辛（A.sieboldii）的甲醇提取物通過激活類鴉片受體（opioid receptor）同時抑制血管緩激肽（bradykinin）和組胺調(diào)節(jié)的機體反應(yīng)來發(fā)揮鎮(zhèn)痛和抗發(fā)炎作用。毛細辛與華細辛同屬，其鎮(zhèn)痛和解熱機理或許可以從中得到啟示。

在抗氧化研究方面，Iwashinaa等［30］研究75種廣義細辛屬植物的黃酮組成，發(fā)現(xiàn)了3個查爾酮和1個橙酮。3個查爾酮為：柑橘酮－2’，4’－二－O－葡糖苷，柑橘酮－4，2’，4’－三－O－葡糖苷，柑橘酮－4－O－葡糖苷（chalcononaringe－nin 2，4’－di－O－glucoside，4，2’，4’－tri－Oglucoside，4－O－glucoside）；1個橙酮鑒定為金魚草素－4，6－二－O－葡糖苷（aureisidin 4，6－di－O－glucoside）。此外，還發(fā)現(xiàn)一些黃酮醇類物質(zhì)，它們是山奈酚－3，7－O－葡糖苷（kaempferol 3，7－O－glycoside），槲皮素（quercetin），異鼠李醇（isorhamnetin），黃酮，芹菜苷元－6，8－二－C－葡糖苷 （apigenin 6，8－di－C－glycoside），黃烷酮，柚苷－5，7－二－O－葡糖苷 （naringenin 5，7－di－O－glucoside），呫噸酮（xanthone）和芒果甙（mangiferin）。這些黃酮類物質(zhì)都有一定的抗氧化活性。

毛細辛中含有 （2S）－柚皮素－5，7－二－O－β－D－吡喃葡萄糖苷，Lin和 Chiou［31］的研究顯示柚皮素對人視網(wǎng)膜色素上皮細胞 （ARPE219）和人臍靜脈內(nèi)皮細胞 （HUVEC）有抗氧化作用，當上述細胞面臨缺氧或者受到NaN3和H2O2氧化脅迫時，一定濃度的柚皮素能提高細胞的生存率，同時對這兩種細胞均有抗氧化作用。那么，毛細辛提取物能否通過發(fā)揮其抗氧化活性來治療老年視網(wǎng)膜黃斑變性將是一個令人期待的問題。

盡管毛細辛及其他細辛屬植物在醫(yī)藥方面的巨大價值和潛能，但是在實際用藥過程中，仍然不得不面對一個頭疼的問題：它們的毒性。Schaneberg和Khan［32］的研究發(fā)現(xiàn)：細辛屬植物具有腎毒性并可能致命的原因是它們都含有馬兜鈴酸 （aristolochic acid）I和II。因而，將毛細辛提取物用于抗氧化劑或其他藥用時，一定要充分考慮安全問題。

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