豬繁殖與呼吸綜合征病毒分離株的致病性研究

楊德康，魏建忠，王桂軍，李 郁

（1.肥東縣動物疫病預(yù)防控中心，安徽肥東 231600；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，安徽合肥 230036）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS））是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的豬的一種病毒性傳染性疾病[1]。該病自發(fā)現(xiàn)以來已經(jīng)給各主要養(yǎng)豬國家?guī)砹司薮蟮慕?jīng)濟(jì)損失。近幾年，安徽省PRRSV的感染豬群以高熱、呼吸困難、皮膚發(fā)紅為特征，出現(xiàn)了高熱、高發(fā)病率、高死亡率、低治愈率的“三高一低”新特點，與以前的PRRS病癥相比有很大差異，為掌握PRRSV安徽分離株的致病性，感染豬的臨床癥狀、剖檢病變、病理組織學(xué)變化，本研究選用所分離的毒株進(jìn)行了仔豬的人工感染試驗[2]。對豬繁殖與呼吸綜合征病毒進(jìn)行致病性研究，為豬繁殖與呼吸綜合征病毒對豬的致病機(jī)制提供理論依據(jù)，為豬繁殖與呼吸綜合征病的防控提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 病毒

PRRSV SCH07毒株。

1.2 實驗動物

來源相同的40日齡健康仔豬4頭，采集血清經(jīng)試劑盒PRRSV抗原和抗體檢測均為陰性。

1.3 主要試劑

豬繁殖與呼吸綜合征RT-PCR檢測試劑盒購自北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司；豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測試劑盒購自美國IDEXX公司；瓊脂糖為Sigma公司產(chǎn)品；其他常規(guī)試劑均為分析純。

2 方法

2.1 病毒的增殖

將PRRSV SCH07的第15代病毒接種于生長48 h形成單層的Marc-145細(xì)胞，接種后吸附1 h，加維持液。每日觀察細(xì)胞，在有80%~90%的細(xì)胞出現(xiàn)病變時收獲病毒。

2.2 病毒半數(shù)細(xì)胞感染量測定（TCID50）

將分離病毒SCH07作10-1~10-8系列稀釋，分別接種于單層Marc-145細(xì)胞96孔培養(yǎng)板，每個稀釋度接8孔，每孔0.1 mL，37 ℃作用1 h 。每孔再加入0.1 mL維持液，同時設(shè)不接病毒的正常細(xì)胞對照，置于5%的CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)，連續(xù)觀察記錄細(xì)胞病變7 d，結(jié)果按Reed -Muench法計算。

2.3 攻毒試驗

隨機(jī)將試驗豬分成實驗組、陰性對照兩組，每組各2頭，實驗組仔豬經(jīng)口、鼻接種PRRSV SCH07株病毒細(xì)胞培養(yǎng)物， 每頭5 mL；陰性對照組接種正常細(xì)胞培養(yǎng)物，每頭 5 mL，兩組隔離飼養(yǎng)。接種后連續(xù)觀察仔豬的臨床表現(xiàn)、測定體溫，記錄發(fā)病和死亡情況，分別在第3、7、10、20、30、40天各采血一次，供檢測抗體。

2.4 血清中PRRSV 抗體的檢測

用豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測試劑盒測定試驗豬血清中PRRSV抗體，按試劑盒說明書方法進(jìn)行，S/P≥0.4 為陽性，S/P＜0 .4為陰性。

2.5 病料中PRRSV的檢測

采集實驗豬的肺、脾、腎、心、淋巴結(jié)等組織樣品，經(jīng)混樣處理，用豬繁殖與呼吸綜合征RT-PCR檢測試劑盒檢測PRRSV，按試劑盒說明書方法進(jìn)行。

2.6 石蠟切片的制作

采集心、肺、脾、肝、腎、淋巴結(jié)等組織樣品；10%福爾馬林固定、石蠟包埋、切片、HE染色、光學(xué)顯微鏡下觀察。

2.7 鑒別診斷

無菌操作挑取攻毒組死亡豬的脾、肝組織，在兔血瓊脂平板上劃線進(jìn)行細(xì)菌分離，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果；對發(fā)病豬的組織病料、分離株細(xì)胞培養(yǎng)物、攻毒發(fā)病仔豬組織病料進(jìn)行PRRSV的RT-PCR檢測，按試劑盒說明書方法進(jìn)行。

3 結(jié)果

3.1 分離病毒的TCID50測定結(jié)果

按Reed Muench法計算得出TCID50結(jié)果為104.7/0.1 mL，分離病毒在Marc-145細(xì)胞上的毒價為10-4.7TCID50/0.1 mL。

3.2 臨床癥狀

接毒組的仔豬在接毒3~4 d后，體溫升高至41 ℃以上，持續(xù)高熱9~15 d（圖1）。發(fā)病初期臨床表現(xiàn)為食欲不振，精神沉郁，眼分泌物增多、有淚斑，呼吸困難、偶有嗆咳，腹部皮膚發(fā)紅，糞便干結(jié)，伴有間歇性腹瀉，尿少而黃；后期表現(xiàn)為消瘦、后肢無力，喜臥，耳尖、腹下和四肢末梢皮膚發(fā)紫等癥狀。接毒后15 d病情嚴(yán)重的一頭豬死亡，瀕死前有肌肉震顫、四肢劃水樣等神經(jīng)癥狀；另一頭耐過，但生長極為緩慢，在高溫、高濕的天氣條件下病情出現(xiàn)反復(fù)，對照組無明顯異常變化。

3.3 剖檢病變

剖檢發(fā)現(xiàn)仔豬肺呈暗紅色，肺間質(zhì)增寬明顯，膈葉、心葉有散在的出血點和肉樣變，肺的彈性減弱；腹股溝淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、肺門淋巴結(jié)腫大、出血，脾臟腫脹、切面外翻，邊緣有多邊形暗紅色梗死灶，背面有丘疹狀突起，腎臟表面有少量針尖大出血點，心包積液。其他臟器無明顯肉眼病變；耐過豬第150 d宰殺，剖檢可見肺呈肉樣變，膈葉、心葉有灶性暗紅色實變，其他臟器無明顯肉眼病變（圖2、圖3、圖4）。

3.4 病理組織檢查

肺臟 肺組織發(fā)生彌漫性或局灶性纖維性肺炎，表現(xiàn)為細(xì)支氣管上皮細(xì)胞腫脹、有的脫落， 管腔內(nèi)滲出物中有少量脫落的上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。肺泡隔因巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤及間質(zhì)增生而明顯增厚， 肺泡壁細(xì)胞腫脹，變圓，肺泡中充斥著大量的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞、脫落的上皮細(xì)胞、含鐵血黃素顆粒及粉紅色炎性滲出物，局部肺泡出現(xiàn)幾個肺泡相互融合， 形成肺氣腫[4]（圖5）。

淋巴結(jié) 皮質(zhì)內(nèi)淋巴小結(jié)固有結(jié)構(gòu)遭受破壞，界限不清楚，淋巴細(xì)胞變性壞死 ，淋巴結(jié)髓質(zhì)界限不清晰，細(xì)胞排列松散。髓質(zhì)部有出血現(xiàn)象、髓竇里充滿紅細(xì)胞，髓索有炎性細(xì)胞浸潤（圖6）。

脾臟 脾小體輪廓不清，淋巴細(xì)胞和網(wǎng)狀細(xì)胞崩解、碎裂，在白髓和紅髓均可見紅細(xì)胞蓄積和巨噬細(xì)胞增生，脾索腫脹、細(xì)胞變性、壞死。部分脾臟內(nèi)可見脾小體中心壞死、巨噬細(xì)胞、大量網(wǎng)狀細(xì)胞增生和含鐵血黃素顆粒沉著（圖7）。

腎臟 皮質(zhì)出血，腎小球腫脹，腎小管腫脹，上皮細(xì)胞顆粒性變性，致使管腔狹窄；集合管尿潴留，管腔增大，腎小球周圍和腎曲管之間的間質(zhì)中有大量淋巴細(xì)胞和少量巨噬細(xì)胞浸潤（圖8）。

心臟 局部心肌纖維間有紅細(xì)胞滲出、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤（圖9）。

3.5 抗體檢測結(jié)果

接毒組在第7天血清中首次檢測到抗體，在第40天的血清中仍能檢測到抗體；對照組一直為陰性（表1）。

表1 接毒組血清中PRRSV抗體檢測結(jié)果表

3.6 RT -PCR鑒定結(jié)果

對發(fā)病豬的組織病料、分離株細(xì)胞培養(yǎng)物、攻毒發(fā)病仔豬組織病料進(jìn)行PRRSV的RT-PCR檢測，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，均可擴(kuò)增出約400 bp大小的條帶 ，與陽性對照相符；陰性對照未見條帶（圖10）。

3.7 鑒別診斷結(jié)果

血平板上未見有任何細(xì)菌生長 豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒的RT-PCR檢測為陰性，說明試驗豬沒有繼發(fā)感染。

4 討論

經(jīng)典的PRRSV 主要是引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙和仔豬的呼吸道癥狀，但2006年以后國內(nèi)暴發(fā)的病例中出現(xiàn)許多成年豬死亡的病例[3]。本試驗所用的SCH07毒株根據(jù)基因測序結(jié)果為美洲型PRRSV變異株，致病性試驗結(jié)果表明該毒株第15代細(xì)胞培養(yǎng)物能夠引起仔豬明顯的PRRS臨床癥狀和剖檢病變：出現(xiàn)持續(xù)高熱、豬體溫升高持續(xù)15~18 d，發(fā)病豬耳根、腹部皮膚發(fā)紅、呼吸困難的癥狀，剖檢肺臟和脾臟都有明顯的病變。發(fā)病率達(dá)100%；死亡率為50%，且從攻毒后死亡試驗豬的肺臟和耐過試驗豬的血清中均可檢測到PRRSV變異株。本試驗結(jié)果與近期報道的高致病性PRRSV變異株人工感染豬的試驗結(jié)果基本一致，但與國內(nèi)早期的PRRSV人工感染試驗的臨床癥狀不明顯和不引起死亡的結(jié)果有一定區(qū)別，說明變異株致病性增強(qiáng)，且發(fā)病情況可能與飼養(yǎng)環(huán)境有一定關(guān)系，不利環(huán)境可能會誘發(fā)其發(fā)病[4]。

本試驗的病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，PRRS的主要病變在肺臟、脾臟和淋巴結(jié)。肺臟出現(xiàn)以肺泡膈增寬和伴有巨噬細(xì)胞增生為特點的間質(zhì)性肺炎，這可能是試驗豬出現(xiàn)呼吸困難的直接原因之一[5-7]。通過病理組織學(xué)觀察我們發(fā)現(xiàn)病豬全身淋巴結(jié)、脾臟的淋巴組織嚴(yán)重出血、壞死嚴(yán)重，驗證了PRRS是免疫抑制性疾病，會造成機(jī)體細(xì)胞免疫機(jī)能降低，易導(dǎo)致繼發(fā)感染其他疾病[8-10]。

目前，PRRS的治療還沒有特效藥物，其防控主要依賴免疫疫苗，在生產(chǎn)實踐中，用PRRSV疫苗的免疫效果不是很理想，可能與PRRS是免疫抑制性疾病，或者是豬群本來就存在其他免疫抑制性疾病的隱性感染，免疫系統(tǒng)受到破壞有關(guān)，但本研究在實驗過程中發(fā)現(xiàn)：在接毒后第15 d，用相同毒價、方法和2倍劑量對耐過豬重新接毒一次，兩天后，接毒豬只表現(xiàn)出輕微的癥狀，后逐漸康復(fù)。說明耐過豬體內(nèi)的抗體水平已能抵御強(qiáng)毒的侵襲，因此，預(yù)防該病所選用的疫苗株和當(dāng)?shù)亓餍卸局昊蚪M的吻合率，應(yīng)引起重視。

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