食品微生物快速檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

鄒小龍，姜川，郝大偉

（麗水市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測(cè)院，浙江麗水323000）

食品微生物快速檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

鄒小龍，姜川，郝大偉

（麗水市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測(cè)院，浙江麗水323000）

快速檢測(cè)食品中微生物的方法在食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方面起著越來越重要的作用，最終將達(dá)到預(yù)防腸道傳染病和食物中毒的發(fā)生的目的。快速方法包括電化學(xué)法、細(xì)菌直接計(jì)數(shù)法、免疫學(xué)技術(shù)、PCR法、全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)等。對(duì)上述各種快速檢測(cè)食品中微生物的方法作一綜述。

快速檢測(cè)；食品；微生物

Abstract:The rapid detection of microorganisms in food testing methods in food hygiene plays an increasingly important role,will eventually be able to prevent the occurrence of food-borne diseases and food poisoning purposes.Rapid methods include electrochemical method,bacterial direct counting method,immunological techniques,PCR method,fully automated microbial analysis system.In this paper,the above-mentioned rapid detection method of micro-organisms in food are reviewed.

Key words：rapid detection;food;microbial

20世紀(jì)90年代末至今，全球食品安全惡性事件頻發(fā)，食源性疾病已經(jīng)成為影響公共健康的重要因素。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，發(fā)達(dá)國家每年約有三分之一的人感染食源性疾病，而且在一些發(fā)展中國家，食源性疾病往往是致人非正常死亡的主要原因。根據(jù)不同的資料來源，全世界每年有220萬～1000萬人因患食源性疾病而喪生。食源性疾病主要是由微生物和化學(xué)藥物所引起的，其中微生物引起的食源性疾病占具一半以上的比例。食品中的微生物污染成為食品安全的首要問題。微生物污染存在在食品生產(chǎn)、加工、儲(chǔ)存、運(yùn)輸、銷售、到食用的整個(gè)過程的每個(gè)環(huán)節(jié)中，對(duì)人體產(chǎn)生嚴(yán)重的危害。常規(guī)的檢驗(yàn)大多通過培養(yǎng)基培養(yǎng)目標(biāo)微生物，然后利用肉眼或放大鏡觀察計(jì)數(shù)的方式，來確定食品是否受到此微生物的污染。常規(guī)檢測(cè)手段由于步驟繁雜，判斷指標(biāo)一般都需要肉眼觀察，因此檢測(cè)時(shí)間較長，少則2 d～3 d，多至數(shù)周，才能確定。這往往無法滿足現(xiàn)代化食品工業(yè)以及社會(huì)發(fā)展的食品安全快速檢測(cè)需求。如何快速、實(shí)時(shí)、現(xiàn)場(chǎng)的檢測(cè)食品微生物污染成為目前急需解決的技術(shù)問題。

鑒于食品工業(yè)對(duì)微生物快速檢測(cè)的需求，微生物快速檢測(cè)技術(shù)得到了迅速的發(fā)展。各種基于不同類型的新型快速檢測(cè)技術(shù)相繼出現(xiàn)。例如，利用培養(yǎng)基電化學(xué)性質(zhì)變化檢測(cè)微生物；基于流式細(xì)胞儀和固相細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的細(xì)菌直接計(jì)數(shù)法；基于抗原抗體免疫學(xué)技術(shù)的快速檢測(cè)技術(shù)；基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的微生物快速檢測(cè)技術(shù)；傳統(tǒng)生化反應(yīng)及微生物檢測(cè)技術(shù)與現(xiàn)代計(jì)算機(jī)技術(shù)相結(jié)合的集成化商品化快速分析系統(tǒng)等等。本文將對(duì)各類微生物快速檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行詳細(xì)闡述。

1 基于電化學(xué)原理的微生物快速檢測(cè)技術(shù)

電化學(xué)阻抗技術(shù)是指細(xì)菌在培養(yǎng)基內(nèi)生長繁殖的過程中，會(huì)使培養(yǎng)基中的大分子電化學(xué)惰性物質(zhì)，如碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂類等代謝為具有電活性的小分子物質(zhì)，如乳酸鹽、醋酸鹽等，這些離子態(tài)物質(zhì)能增加培養(yǎng)基的導(dǎo)電性和氧化還原性，使培養(yǎng)基的電化學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化。通過檢測(cè)培養(yǎng)基的在電極表面體現(xiàn)的電壓、電流、電阻抗等變化情況，即可判定細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長、繁殖特性。該法已用于食品中細(xì)菌總數(shù)、大腸桿菌、沙門氏菌、酵母菌、霉菌和支原體的檢測(cè)，具有高敏感性、特異性、快速反應(yīng)性和高度重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)。

國外在此領(lǐng)域的研究工作開展相對(duì)較早。1979年T.Matsunaga首次實(shí)現(xiàn)了燃料電池型電極系統(tǒng)對(duì)培養(yǎng)液中細(xì)菌進(jìn)行了快速測(cè)定。此系統(tǒng)由雙電極體系構(gòu)成，每一電極均由鉑陽極和Ag2O2陰極復(fù)合而成，在參比電極陽極表面覆有纖維素透析膜，用于扣除基體電流對(duì)測(cè)定的干擾。檢測(cè)結(jié)果顯示，工作電極與參比電極電流之差與微生物濃度呈線性關(guān)系，響應(yīng)時(shí)間為15 min，檢測(cè)限為 107cell/mL[1]。1982 年 Nishikawa將上述檢測(cè)系統(tǒng)加以改進(jìn)。使用微孔濾膜富集微生物，使用2，6-二氯酚靛酚作為電子傳遞媒介，增大了響應(yīng)電流，顯著的提高了檢測(cè)限，達(dá)到104cell/mL[2]。1984年T.matsunaga又開創(chuàng)了平面熱解石墨電極為工作電極的循環(huán)伏安法檢測(cè)微生物細(xì)胞。實(shí)現(xiàn)了幾種微生物細(xì)胞的識(shí)別，第一次提出可利用生物傳感器進(jìn)行細(xì)胞種類的識(shí)別[3]。1988年G.Ramsay等首次利用伏安型細(xì)胞傳感器進(jìn)行了菌數(shù)濃度的測(cè)定。以E.coli為試驗(yàn)菌種，鐵氰化鉀為電子傳遞媒介，利用微機(jī)化極譜儀控制工作電極（Pt電極）電位在﹢400 mV（vs Ag/AgCl電極)，測(cè)量電流對(duì)的時(shí)間斜率，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)生肉、牛奶、廢水中微生物濃度的監(jiān)測(cè)，響應(yīng)時(shí)間小于1 min[4]。

國內(nèi)在基于電化學(xué)技術(shù)的微生物快速檢測(cè)技術(shù)研究雖然起步相對(duì)較晚，但是發(fā)展非常迅速，也取得了不少研究成果。1992年，許春向等利用電化學(xué)方法，分別研究了以2，6-二氯酚靛酚（DCIP）和4，4'-聯(lián)吡啶為電子傳遞體的伏安型微生物快速測(cè)定傳感器。研究表明，以2，6-二氯酚靛酚（DCIP）為電子傳遞體的微生物細(xì)胞傳感器可連續(xù)監(jiān)測(cè)啤酒發(fā)酵罐中酵母菌總數(shù)的燃料電池型細(xì)胞傳感器，響應(yīng)時(shí)間為5 min，電極壽命大于150 d[5]。以一聯(lián)毗啶為電子傳遞體的微生物細(xì)胞傳感器不但能夠用于微生物的計(jì)數(shù)，同時(shí)能夠用于微生物細(xì)胞的識(shí)別。研究實(shí)現(xiàn)了對(duì)啤酒酵母菌、枯草桿菌和大腸桿菌的檢測(cè)。細(xì)胞識(shí)別傳感器除了可以識(shí)別一些微生物細(xì)胞、動(dòng)物及人的淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞外，尚可識(shí)別革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌[6]。2001年，北京檢驗(yàn)檢疫局的陳廣全等人實(shí)現(xiàn)了以改進(jìn)的沙門氏菌選擇培養(yǎng)基四硫磺酸鹽煌綠增菌培養(yǎng)基（TTB）為培養(yǎng)基，以電化學(xué)阻抗技術(shù)為測(cè)量手段，通過在培養(yǎng)基中加入氧化三甲氨增加培養(yǎng)基的電阻抗變化靈敏度，連續(xù)檢測(cè)沙門氏菌代謝所引起培養(yǎng)基的電阻抗變化值，利用培養(yǎng)基電阻抗降低的百分比判定沙門氏菌的存在。經(jīng)與常規(guī)培養(yǎng)法進(jìn)行比較，對(duì)加入食品中的21種已知沙門氏菌屬的檢測(cè)，電阻抗法19個(gè)為陽性，檢出率在90%以上，常規(guī)法檢出18個(gè)，檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)培養(yǎng)法相一致，對(duì)于陰性結(jié)果能在48 h內(nèi)出具結(jié)果。結(jié)果表明電阻抗法能夠快速、可靠地檢測(cè)食品中的沙門氏菌[7]。2005年，西安電子科技大學(xué)的周永軍等也實(shí)現(xiàn)了以色素還原試驗(yàn)法為基礎(chǔ)，通過添加適量的生物催化劑和離子激勵(lì)劑，實(shí)現(xiàn)一種能快速測(cè)定奶乳制品中細(xì)菌含量的電化學(xué)生物傳感器，并對(duì)牛奶中的雜菌進(jìn)行了測(cè)量。研究結(jié)果表明，該生物傳感器能有效的測(cè)定鮮奶中的微生物含量。它相對(duì)于傳統(tǒng)活菌落檢測(cè)方法相比，具有快速、簡(jiǎn)便、實(shí)時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[8-9]。

2 基于細(xì)菌直接計(jì)數(shù)法的微生物快速檢測(cè)技術(shù)

基于細(xì)菌直接技術(shù)法的微生物快速檢測(cè)技術(shù)主要包括流式細(xì)胞儀（FCM）和固相細(xì)胞計(jì)數(shù)（SPC）法。FCM通常以激光作為發(fā)光源，經(jīng)過聚焦整形后的光束垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細(xì)胞在激光束的照射下產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。光散射信號(hào)基本上反映了細(xì)胞體積的大小，熒光信號(hào)的強(qiáng)度則代表了所測(cè)細(xì)胞膜表面抗原的強(qiáng)度或其核內(nèi)物質(zhì)的濃度，由此可通過儀器檢測(cè)散射光信號(hào)和熒光信號(hào)來估計(jì)微生物的大小、形狀和數(shù)量。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)具有高度的敏感性，可同時(shí)對(duì)目的菌進(jìn)行定性和定量[10]。2000年，澳大利亞麥夸里大學(xué)的S.Gunasekera等實(shí)現(xiàn)了用流式細(xì)胞術(shù)快速檢測(cè)牛奶中的菌落總數(shù)，解決了牛奶中蛋白質(zhì)和脂質(zhì)顆粒對(duì)流式細(xì)胞技術(shù)中的影響問題，建立了基于清除牛奶中酶的應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)快速檢測(cè)（1 h以內(nèi)）牛奶中菌落總數(shù)的方法。當(dāng)把細(xì)菌添加到經(jīng)過超熱處理的牛奶中時(shí)，在流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)與傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法二者之間具有很好的相關(guān)性（r≥0.98）。對(duì)于原料奶的檢測(cè)呈顯著相關(guān)（P＜0.01），并且二者之間具有很好的相關(guān)性（r=0.91）。此方法的檢測(cè)限為≤104/mL牛奶，滿足許多國家和地區(qū)的安全標(biāo)準(zhǔn)[11]。目前，流式細(xì)胞技術(shù)已經(jīng)建立了細(xì)菌總數(shù)、致病性沙門菌、大腸埃希氏菌等的快速檢驗(yàn)方法。

固相細(xì)胞計(jì)數(shù)可以在單個(gè)細(xì)胞水平對(duì)細(xì)菌進(jìn)行快速檢測(cè)[12]。濾過樣品后，存留的微生物在濾膜上進(jìn)行熒光標(biāo)記，采用激光掃描設(shè)備自動(dòng)計(jì)數(shù)。每個(gè)熒光點(diǎn)可直觀地由通過計(jì)算機(jī)驅(qū)動(dòng)的流動(dòng)臺(tái)連接到ChemScan上的落射熒光顯微鏡來檢測(cè)，尤其對(duì)于生長緩慢的微生物，檢測(cè)用時(shí)短使該方法明顯優(yōu)于傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法[13]。2001年，H.Perry-O'Keefe等應(yīng)用過濾器肽核酸原位雜交對(duì)特殊微生物進(jìn)行檢測(cè)、識(shí)別和計(jì)數(shù)?；谀み^濾方法，通過原位雜交來分析小菌落，過氧化物酶標(biāo)記的PNA探針，靶點(diǎn)為特異的rRNA序列，再利用直觀的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，使小菌落能夠在膜上形成發(fā)光的小亮點(diǎn)而被觀測(cè)到。此方法與傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法相比有95%～100%的相似。應(yīng)用這種方法比常規(guī)的培養(yǎng)法檢測(cè)革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌以及酵母菌時(shí)間要縮短3倍以上[14]。

3 基于PCR的微生物快速檢測(cè)技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR（Polymerase Chain-Reaction）是美國科學(xué)家Mullis于1983年發(fā)明的一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法。故又稱為基因的體外擴(kuò)增法。它可以在試管中建立反應(yīng)，數(shù)小時(shí)后能將極微量的目的基因或某一特定的DNA片段擴(kuò)增數(shù)十萬乃至千百萬倍。即可將皮克（pg）水平的DNA特異地?cái)U(kuò)增到能夠檢測(cè)的微克（μg）水平。無須通過繁瑣費(fèi)時(shí)的基因克隆程序，便可以獲得足夠數(shù)量的精確的DNA拷貝。微生物快速檢測(cè)中，可以利用PCR技術(shù)將特異性DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增識(shí)別目標(biāo)細(xì)菌。由于PCR靈敏度高，理論上可以檢出一個(gè)細(xì)菌的拷貝基因，因此在細(xì)菌的檢測(cè)中只需短時(shí)間增菌甚至不增菌，即可通過PCR進(jìn)行篩選，節(jié)約了大量時(shí)間。

2007年，美國疾病與預(yù)防控制中心的F.C.Tenover利用PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了耐甲氧苯青霉素金黃色葡萄球菌、耐萬古霉素腸球菌、耐多藥結(jié)核分枝桿菌等常規(guī)難以快速檢測(cè)的多種菌的快速檢測(cè)?；诜肿由飳W(xué)的檢測(cè)技術(shù)能夠在約1 h從鼻孔中檢測(cè)出耐甲氧苯青霉素金黃色葡萄球菌，約4 h從直腸樣本中分離出腸球菌的耐萬古霉素A和B基因。新型焦磷酸實(shí)驗(yàn)可以在一天之內(nèi)從分枝桿菌陽性株肉湯培養(yǎng)基上直接得到耐多藥結(jié)核分枝桿菌的結(jié)果。這些數(shù)據(jù)對(duì)醫(yī)生在治療以及感染控制方面都有所幫助[15]。當(dāng)然，PCR技術(shù)也存在一些缺點(diǎn)：食物成分、增菌培養(yǎng)基成分和其他微生物DNA對(duì)Taq酶具有抑制作用，可能導(dǎo)致檢驗(yàn)結(jié)果假陰性；操作過程要求嚴(yán)格，微量的外源性DNA進(jìn)入PCR后可以引起無限放大產(chǎn)生假陽性結(jié)果，擴(kuò)增過程中有一定的裝配誤差，會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響等等。

4 基于免疫學(xué)的微生物快速檢測(cè)技術(shù)

免疫學(xué)技術(shù)通過抗原和抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)，再輔以免疫放大技術(shù)來鑒別細(xì)菌。免疫方法的優(yōu)點(diǎn)是樣品在進(jìn)行選擇性增菌后，不需分離，即可采用免疫技術(shù)進(jìn)行篩選。由于免疫法有較高靈敏度，樣品經(jīng)增菌后可在較短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到檢出度，抗原和抗體的結(jié)合反應(yīng)可在很短時(shí)間內(nèi)完成[16]。膠體免疫層析法能快速、靈敏檢測(cè)金黃色葡萄球菌，應(yīng)用膠體金免疫層析法檢測(cè)食品中的沙門菌，簡(jiǎn)便快速，無需特殊儀器設(shè)備，適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)之用。

2005年，M.N.Widjojoatmodjo等實(shí)現(xiàn)了應(yīng)用磁免疫技術(shù)，再結(jié)合PCR方法快速檢測(cè)沙門氏菌。他們使用涂有沙門氏菌單克隆抗體的磁性粒子從樣品中提取細(xì)菌，結(jié)果獲得了一些細(xì)胞溶解的，包含細(xì)菌DNA的浮在表面的，來自鼠傷寒沙門氏菌中的引物，DNA復(fù)制起點(diǎn)163 bp的區(qū)域。引物的特異性被設(shè)定在PCR中，所有25個(gè)沙門氏菌屬的菌株都用來進(jìn)行試驗(yàn)，但不包括腸桿菌科的其他19個(gè)屬的菌種。100 CF敏感度的鼠傷寒沙門氏菌通過瓊脂糖凝膠電泳染色得到的增強(qiáng)的樣品。放大的產(chǎn)物通過Southern雜交得到了10倍于初始的敏感度。107cfu的大腸桿菌檢測(cè)水平?jīng)]有任何干擾。因此磁免疫PCR方法能在5 h之內(nèi)，對(duì)于快速檢測(cè)醫(yī)學(xué)樣品和食品中的沙門氏菌更加有效[17]。

5 集成化商品微生物快速分析系統(tǒng)

微生物快速檢測(cè)除了在研究層面上不斷創(chuàng)新與深入，同時(shí)商品化實(shí)用型儀器也不斷涌現(xiàn)，例如法國梅里埃VITEK系列全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)、美國的mini-VIDAS熒光酶標(biāo)分析儀、意大利的ATB微生物分析系統(tǒng)以及美國的Bactometer全自動(dòng)微生物檢測(cè)計(jì)數(shù)儀等等。此類實(shí)用型微生物分析儀一般都由傳統(tǒng)生化反應(yīng)及微生物檢測(cè)技術(shù)與現(xiàn)代計(jì)算機(jī)技術(shù)相結(jié)合，運(yùn)用概率最大近似值模型進(jìn)行自動(dòng)微生物檢測(cè)，可鑒定由環(huán)境、原料及產(chǎn)品中分離的微生物。一般僅需4 h～18 h即可報(bào)告結(jié)果，以常規(guī)法鑒定細(xì)菌，只能得到是或不是某種菌，要想知到是哪種菌還要做大量、煩瑣的生化試驗(yàn)，而集成化商品化分析儀一般在短時(shí)間內(nèi)即可直接報(bào)告是什么菌。法國生物梅里埃集團(tuán)公司出品的Vitek-AMS自動(dòng)微生物檢測(cè)系統(tǒng)屬當(dāng)今世界上最為先進(jìn)、自動(dòng)化程度最高的細(xì)菌鑒定儀器之一。Vitek對(duì)細(xì)菌的鑒定是以每種細(xì)菌的微量生化反應(yīng)為基礎(chǔ)，不同種類的Vitek試卡（檢測(cè)卡）含有多種的生化反應(yīng)孔，可達(dá)30種，可鑒定405種細(xì)菌[18]。用AMS明顯縮短腸道菌生化鑒定的時(shí)間，如鑒定沙門菌屬只需4 h，鑒定志賀氏菌屬只需6 h，鑒定霍亂弧菌等致病性弧菌亦只需4 h～13 h?？傊?，隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，可以預(yù)料在不遠(yuǎn)的將來，傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)技術(shù)將逐漸被各種新型簡(jiǎn)便的微生物快速診斷技術(shù)所取代。近年來興起的基因探針技術(shù)及全自動(dòng)微生物檢測(cè)系統(tǒng)，將從根本上改變微生物的檢測(cè)方法，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。

6 總結(jié)與展望

微生物檢測(cè)技術(shù)研究與開發(fā)一直是食品質(zhì)量安全研究的重點(diǎn)、熱點(diǎn)方向之一。傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法雖然消耗的時(shí)間長，效率低，但是它仍然廣泛的應(yīng)用于微生物的檢測(cè)，并作為官方檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)長期應(yīng)用于企業(yè)以及相關(guān)檢測(cè)部門。但是，隨著工業(yè)化的快速發(fā)展以及現(xiàn)代物流技術(shù)的進(jìn)步，對(duì)微生物快速檢測(cè)的需求越來越大，極大的促進(jìn)了各種微生物快速檢測(cè)技術(shù)的研究與開發(fā)。以上介紹的幾種快速檢測(cè)技術(shù)得到了很好的發(fā)展，并且某些已經(jīng)應(yīng)用于實(shí)際工作當(dāng)中。但是，總體來說，大部分微生物快速檢測(cè)技術(shù)還只停留在科學(xué)研究階段，對(duì)微生物識(shí)別的分辨率和計(jì)數(shù)的靈敏度還遠(yuǎn)達(dá)不到實(shí)際的要求，例如食品衛(wèi)生檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中大多數(shù)食物的菌落總數(shù)指標(biāo)限量標(biāo)準(zhǔn)都在103個(gè)/mL～105個(gè)/mL，有的甚至更低。微生物快速檢測(cè)技術(shù)在識(shí)別分辨率及計(jì)數(shù)靈敏度方面還需要進(jìn)一步的改進(jìn)和完善?？傊?，隨著微生物快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，將會(huì)有更多的快速檢測(cè)技術(shù)得到實(shí)際應(yīng)用，并替代傳統(tǒng)分析方法，服務(wù)于各類檢測(cè)部門。

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Rapid Detection Food Microbiology Research Progress

ZOU Xiao-long,JIANG Chuan,HAO Da-wei
(Lishui Testing Institute of Quality Technical Supervision,Lishui 323000,Zhejiang,China)

2011-12-15

浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局一般項(xiàng)目（20070245）

鄒小龍（1965—），男（漢），高級(jí)工程師，碩士，研究方向：食品微生物快速檢測(cè)。