甲基轉移酶SETDB1在口腔癌中的表達及臨床意義

郝妍 白相宇 霍峰 陳喜波

口腔癌是我國的一種高發(fā)癌癥，其發(fā)病率和死亡率逐年增加，對于患者的健康具有嚴重影響[1]?？谇话┙涍^綜合治療后患者的生存期有所提高，但是總體預后依舊較差[2]。SET結構域分支型1(SET domain bifurcated1，SETDBl)是賴氨酸甲基轉移酶SUV39家庭中重要一員，參與基因的甲基化修飾，與多種腫瘤密切相關[3-9]。但是SETDB1在口腔癌發(fā)生發(fā)展中作用的相關研究卻鮮有文獻報道。本文通過檢測SETDB1在口腔癌中的表達并探討其與臨床病理特征的相關性，以期探討其在口腔癌的發(fā)生、發(fā)展中的作用機制。

1 資料與方法

1.1 標本來源

納入2019 年1 月～2021 年1 月于承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院口腔外科手術切除的口腔鱗癌及癌旁組織47 例，術前均未接受過任何治療；取癌組織為實驗組，癌旁正?？谇火つそM織為對照組。47 例患者中(男36 例，女11 例)；≥60 歲42 例，<60 歲5 例；TNM分期：I期18 例，Ⅱ期18 例，Ⅲ期11 例；高分化10 例，中分化32 例，低分化5 例;有淋巴結轉移9 例，無淋巴結轉移38 例。本研究涉及人體組織標本經醫(yī)院倫理委員會批準通過。

1.2 主要試劑

SETDBl單克隆抗體(Abcam公司，英國)；DNA提取試劑盒(北京伊塔生物科技有限公司)；免疫組化SP試劑盒、濃縮型DAB試劑(沈陽萬類生物科技有限公司)；RNA引物(上海博湖生物科技有限公司設計)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)

RNA提取試劑盒提取組織總RNA。取300 ng RNA，應用反轉錄試劑盒進行反轉錄。應用SYBR?Green qPCR Master熒光定量試劑盒(廣州銳博生物科技有限公司)檢測PCAF、KAT5及P300/CBP mRNA的表達，相對表達量為2-ΔΔCt。

1.3.2 免疫組織化學染色SP法 石蠟切片脫蠟，3%甲醇-H2O2溶液及枸櫞酸鈉緩沖液加熱處理組織切片、山羊血清封閉后，I抗溫育(SETDB1單克隆抗體，1∶1 000)，II抗溫育，中間 PBS洗滌,DAB顯色，蘇木素染色，酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固。

1.3.3 Western blot 提取總蛋白，測定蛋白濃度；制備電泳蛋白上樣液，行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，轉膜，加I抗4 ℃過夜(SETDB1單克隆抗體，1∶1 000；GAPDH抗體1∶2 000)；次日孵育II抗，重復洗膜3 次后顯影。

1.3.4 免疫組化結果評分標準 根據(jù)切片染色程度和著色陽性細胞所占百分率進行評價計分(每張切片高倍鏡下隨機觀察10 個視野)；染色強度評分標準(A)：無色(0 分)，淡黃色 (1 分)，棕黃色(2 分)，棕褐色(3 分)。著色陽性細胞所占百分率評分標準(B)：<10%為1 分，10%～50%為2 分，50%～75%為3 分，>75%為4 分。以A+B所得分數(shù)作為評判標準：0～2分為陰性，≥3分為陽性。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 口腔癌和癌旁組織中SETDB1 mRNA的相對表達

qRT-PCR結果顯示口腔癌組織中SETDB1 mRNA相對表達量(3.54±0.12)顯著高于癌旁組織(0.42±0.07)(P<0.05)。

2.2 口腔癌組織和癌旁組織中SETDB1蛋白的表達

免疫組化結果顯示，口腔癌組織中SETDB1陽性表達率為 87.23%(41/47)，癌旁組織陽性表達率僅為17.02%(8/47)(P<0. 05)(表 1，圖 1)。Western blot實驗結果顯示，口腔癌組織中SETDB1的蛋白表達量為(72.36±3.46)%，癌旁組織為(14.53±1.76)%(P<0. 05)(圖 2)。

表 1 口腔癌組織和癌旁組織SETDB1蛋白表達

圖 1 口腔癌和癌旁組織中SETDB1蛋白表達 (SP, ×200)

圖 2 口腔癌和癌旁組織中SETDB1蛋白表達 (Western blot)

2.3 口腔癌組織中SETDB1表達與臨床病理特征的相關性

SETDB1陽性與口腔癌TNM分期、組織分化及淋巴結轉移相關(P<0.05)，與性別、年齡與否無關(P>0.05)(表 2)。

表 2 口腔癌組織中SETDB1表達和臨床病理特征的關系

3 討 論

口腔癌是全世界范圍內第六大常見的癌癥，也是我國一種常見的頭頸部惡性腫瘤，嚴重影響人民群眾的生命健康[10-12]。在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，基因功能紊亂可以引起癌基因的激活和抑癌基因的失活[13-14]。多種不良因素均可引起口腔黏膜基因變異，導致調控失常，從而引起口腔癌的發(fā)生與發(fā)展。因此，從基因分子水平探究診治口腔癌已成為本領域的研究熱點。

研究表明，賴氨酸甲基轉移酶與多種腫瘤的形成有關，甲基轉移酶活性缺失或失調可能是導致腫瘤發(fā)生的原因[15]。SETDB1是賴氨酸甲基轉移酶SUV39家族中重要一員，可以催化組蛋白3第9位點的賴氨酸殘基發(fā)生甲基化[16]。近年來的研究發(fā)現(xiàn), SETDB1在多種惡性腫瘤中均呈現(xiàn)高表達轉態(tài)，且與腫瘤的惡性程度和轉移程度密切相關[17]。Xiao等[18]通過生物信息學分析及系列實驗發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中SETDB1顯著擴增并高度表達且下調SETDB1基因能夠顯著抑制乳腺癌細胞的生物學功能。進一步研究顯示，SETDB1編碼的mRNA 3′UTR區(qū)與MiR-7存在部分互補, 過表達MiR-7會下調SETDB1, 同時上調c-MYC和cyclin D1，并通過抑制STAT3信號通路, 逆轉乳腺癌細胞的轉移途徑[19]。

SETDB1可以作為組蛋白甲基轉移酶通過與TIAM1相互作用促進肝癌細胞的增殖和遷移[20]，同時在結直腸癌中，SETDB1可能促進 Wnt/β-catenin 信號通路激活，促進結直腸癌EMT進程，進而促進結直腸癌發(fā)生[21]。早期非小細胞肺癌組織中SETDB1呈高表達狀態(tài), 與肺癌的病理學特征具有強相關性[22]。在肺癌組織中SETDB1呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，且與肺癌的增殖、侵襲和轉移相關；體外干擾下調SETDB1可以抑制肺癌細胞生物學功能，且抑制裸鼠模型中的肺腫瘤生長，而過表SETDB1則可以增加肺癌細胞的侵襲性[23]。但其他研究者發(fā)現(xiàn)，在非小細胞癌中，SETDB1可以通過調控c-MYC表達而激活Wnt/β-caterin信號通路，進而增強IRES介導與翻譯， 這表明SETDB1增強IRES介導的翻譯可能具有癌癥特異性[24]。董紅玲[25]研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌中SETDBl表達水平異常升高，并與患者不良預后密切相關，SETDBl對卵巢癌患者具有一定的預后評價作用。

目前，SETDBl在口腔癌中的表達情況及臨床意義尚未見相關報道。本研究發(fā)現(xiàn)，口腔癌組織中SETDB1 mRNA相對表達量明顯高于癌旁正?？谇火つそM織；進一步通過免疫組化和Western blot證實癌組織中SETDB1蛋白水平亦呈顯著增高，并與腫瘤分期、組織分化和淋巴結轉移臨床病理特征密切相關。SETDB1在口腔癌Ⅰ期的陽性表達低于Ⅱ期和Ⅲ期，而Ⅱ期的陽性表達率低于Ⅲ期，即隨著口腔癌TNM分期的增加SETDB1陽性表達也逐漸增加，說明SETDB1可能與口腔癌的惡性程度具有密切的相關性。隨著口腔癌分化程度的降低，SETDB1蛋白的陽性表達卻隨之增加，同時有淋巴結轉移同無淋巴結轉移相比具有明顯差異性，淋巴結轉移中SETDB1蛋白的陽性表達顯著升高，說明SETDB1的陽性高表達可能促進了口腔癌的惡性轉化，或抑制了口腔癌細胞自身的凋亡過程，使得口腔癌惡性程度增強，導致其發(fā)生淋巴結轉移。因而，本研究推斷口腔癌中SETDB1的高表達抑制了癌細胞凋亡，促進口腔癌細胞無限制生長及腫瘤的惡性轉化，導致了其局部浸潤和遠處遷移，最終導致患者的生存期下降。同時也說明SETDBl參與了口腔癌的發(fā)生和發(fā)展，是一種重要的促癌蛋白，在促進腫瘤轉移等方面具有重要作用。

綜上所述，SETDBl在口腔癌中高表達以及診斷具有一定的潛在價值。隨著分子生物學的發(fā)展，深入探討SETDBl與口腔癌發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉移及預后的關系，對口腔癌的早期診斷及預后判斷提供分子生物學指標意義重大。