生物體中重金屬元素分析方法的研究進(jìn)展

周瑾艷，保志娟，楊 亦，高富榮

（廣東省計(jì)量科學(xué)研究院，廣東 廣州 510405）

0 引言

近年來，重金屬污染形勢日益嚴(yán)重，其治理已亟不可待。為此，2011年環(huán)境保護(hù)部制定了重金屬污染綜合防治“十二五”規(guī)劃，加強(qiáng)重金屬防治。

現(xiàn)已知的重金屬約40種，大部分重金屬如汞、鉛、鎘等非生命活動所必需，且所有重金屬超過一定濃度對人體均有害。進(jìn)入人體內(nèi)的重金屬，大部分與蛋白質(zhì)、核酸發(fā)生相互作用，導(dǎo)致酶活性消失或減弱，核酸結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，引起基因突變。此外，重金屬進(jìn)入生物機(jī)體內(nèi)，不易在肝臟分解代謝，極易積存在大腦、腎臟等器官，漸進(jìn)式地?fù)p壞機(jī)體功能。研究表明，大部分的阿耳滋海默氏病和帕金森病都與重金屬過量有關(guān)[1]。

目前，生物體內(nèi)重金屬監(jiān)測主要集中在血液、尿液、唾液、頭發(fā)、指甲、胎盤、肝、腎等軟組織以及骨骼、牙齒等樣本中[2]。血液和尿液中的重金屬含量為即時(shí)信息，而指甲、毛發(fā)及骨骼中含量反映了生物體內(nèi)重金屬元素的長期積累狀況。該文就這些生物樣品中重金屬的前處理及檢測方法進(jìn)行綜述。

1 樣品的前處理

生物機(jī)體樣品中含有大量的鹽分和有機(jī)質(zhì)，而重金屬元素含量一般在μg級，因此需要將樣品進(jìn)行前處理和富集，制得合適的供試液。生物樣品常用的前處理方法主要有直接稀釋法、濕法消解法和微波消解法。

通常標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品存在粘度差異，可能影響準(zhǔn)確度，且大比例的稀釋也會影響元素的檢出能力。故直接稀釋法中常采用基體改進(jìn)劑稀釋樣品。目前，基體改進(jìn)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于石墨爐原子吸收測定生物和環(huán)境樣品中的痕量金屬元素及其化學(xué)形態(tài)，但對于基體改進(jìn)的機(jī)理，目前的研究工作尚不多，還未建立起一般的理論來解釋觀測到的眾多基體改進(jìn)效應(yīng)。

強(qiáng)氧化酸濕法消解成本較低，但酸液用量大，空白值較高，且易被污染。微波消解具有消化樣品能力強(qiáng)、速度快、消耗化學(xué)試劑少、金屬元素不易揮發(fā)損失、污染小及空白值低等優(yōu)勢。

2 檢測方法

目前，用于生物機(jī)體中重金屬檢測的方法主要有中子活化法（NAA）、電化學(xué)方法、原子熒光光度法（AFS）、原子吸收分光光度法（AAS）、電感藕合等離體原子發(fā)射光譜法（ICP-AES）、電感藕合等離子體質(zhì)譜分析技術(shù)（ICP-MS）、生物分析法等。

2.1 中子活化法

中子活化分析是一種權(quán)威的元素測量方法，是通過鑒別和測試試樣因輻照感生的放射性核素的特征輻射，進(jìn)行元素和核素分析的放射分析方法。該法靈敏度高，準(zhǔn)確度和精密度也很高，可測定元素范圍廣。中子活化法很早便廣泛用于生物樣品中痕量金屬元素的檢測。1965年，中子活化法被應(yīng)用于尿液中Mn的檢測。隨后，Brune等[3]比較了正常人與尿毒癥患者全血中As，Au等8種元素的含量。同樣的方法也用于不同人群血清、尿液、頭發(fā)中鈾元素的含量分布檢測，檢出濃度達(dá)到ng/g水平。常規(guī)中子活化分析無法利用核反應(yīng)截面高而生成穩(wěn)定核素的核反應(yīng)，而瞬發(fā)γ射線中子活化分析卻能夠克服這一困難。Grinyer等[4]利用該方法研究了腎、肝中鎘元素含量，檢測下限可達(dá)3.3×10-6。由于可避免化學(xué)操作引入的不確定度，且具有無損性、高靈敏度及計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)不確定度可定量描述等優(yōu)點(diǎn)，中子活化分析也常被作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)元素定值的權(quán)威方法。Ewelina等[5]研究了中子活化分析生物樣品中硒元素含量，方法不確定度完全滿足測試要求。韓國技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)研究院（KRISS）研制的牡蠣標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（108-04-001）也采用中子活化分析法定值，分析結(jié)果與通過認(rèn)證的標(biāo)準(zhǔn)值在不確定度范圍內(nèi)具有良好的一致性[6]。

2.2 電化學(xué)方法

電化學(xué)在20世紀(jì)最大的發(fā)展成果首當(dāng)極譜分析法。極譜法測定重金屬元素，儀器簡單，分析速度快。然而經(jīng)典極譜法具有較大的局限性，研究者們發(fā)展了許多現(xiàn)代極譜分析技術(shù)，其中陽極溶出伏安法應(yīng)用最廣。Jagner等[7]曾報(bào)道過電位溶出分析法（PSA）測定血鉛，溶出峰不受溶解氧的影響。Benjamin等[8]研究者采用方波陽極溶出伏安法測血鉛，選用10 μm碳圓盤超微電極，大大提高了分析靈敏度和選擇性，能很好地抗汞離子干擾。

2.3 原子熒光光度法

原子熒光光度法，多用于鉛、汞、砷、銻、鉍、硒、鎵、鍺、錫、鋅、錫的分析。多技術(shù)聯(lián)用是其近年來發(fā)展的重點(diǎn)。1999年，Slejkovec等[9]聯(lián)用高效液相色譜法、紫外可見光譜法、氫化物發(fā)生-原子熒光法[HPLC-（UV）-HG-AFS]，研究了 6 種生物相關(guān)的砷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，能很好地區(qū)分至少6種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的砷化合物，推動了砷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在定量檢測中的發(fā)展。Gómez-Ariza 比 較 了 HPLC-（UV）-HG-AFS 和HPLC-（UV）-HG-ICP-MS 兩種不同的聯(lián)用技術(shù)[10]，結(jié)果顯示兩種方法都能取得很好的實(shí)驗(yàn)效果，HPLC-（UV）-HG-AFS方法還能很好地區(qū)分人尿中不同形態(tài)的銻。氫化物發(fā)生-原子熒光法聯(lián)用離子色譜技術(shù)（IC-HG-AFS）也被應(yīng)用于 As（III）、As（V）及甲基胂酸（MMA）、二甲基胂酸（DMA）的檢測[11]。

2.4 原子吸收分光光度法

原子吸收光譜法是目前生物樣品金屬元素測定最常用的方法之一。石墨爐原子吸收光譜法（GFAAS），結(jié)合“基體改進(jìn)”技術(shù)后，可以更準(zhǔn)確、更真實(shí)地定量反映生物監(jiān)測材料中痕量有毒有害金屬元素的含量（一般在0.1~100μg/L的范圍內(nèi)）。Gil等[12]建立了檢測全血、尿液、毛發(fā)、唾液中 Cr，Cd，Mn，Ni和Pb等元素的原子吸收標(biāo)準(zhǔn)方法，通過測試全血（refs.201505，201605，201705）、尿 液（ref.201205）、毛 發(fā)（NIES No.5）等標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，驗(yàn)證了方法準(zhǔn)確性。

隨著對方法靈敏度和檢測下限的需求，出現(xiàn)了各種富集手段。Santos等[13]利用O，O-二乙基二硫代磷酸酯（DDTP）和離子交換樹脂XAD-4萃取劑，結(jié)合火焰原子吸收方法，在線富集檢測生物樣品中的Cd含量。方法通過有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)驗(yàn)證，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3%左右。同時(shí)，6-巰基吡啶偶氮樹脂對生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中Cu，Zn，Cd的分離效果顯著，選擇性極高，方法簡單快速，無干擾。Huang等[14]合成了巰基丙基三甲氧基硅烷修飾的二氧化硅磁性納米顆粒，固相萃取了生物和環(huán)境樣品中Cd，Cu，Hg和Pb。目標(biāo)金屬的磁性顆粒在磁場作用下極易從溶液中分離，無需過濾和離心。結(jié)合AAS分析4種目標(biāo)金屬含量，檢出限分別可達(dá) 24，92，107，56pg/L。

2.5 電感藕合等離子體原子發(fā)射光譜（ICP-AES）及電感藕合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）分析技術(shù)

電感耦合等離子體發(fā)射光譜法，也是常用的生物機(jī)體中微量重金屬的檢測技術(shù)，但當(dāng)樣品含量（濃度）較大時(shí)，準(zhǔn)確度較差，而且該方法只能用于元素分析，不能進(jìn)行結(jié)構(gòu)、形態(tài)的測定。

鑒于上述問題，研究者們將ICP技術(shù)與質(zhì)譜方法聯(lián)用，發(fā)展了具有極好靈敏度和高效樣品分析能力的多元素分析技術(shù)-電感耦合等離子體質(zhì)譜法。近年來用于生物機(jī)體中痕量元素的檢測是ICP-MS的研究熱點(diǎn)[15]。低溫等離子技術(shù)、碰撞/反應(yīng)池技術(shù)的實(shí)現(xiàn)大大降低了多原子光譜的干擾程度，提高了四極桿ICP-MS分析能力。David等[16]用電感耦合等離子體-動態(tài)反應(yīng)池-質(zhì)譜法（ICP-DRC-MS）測試了全血和尿液中砷、鉛、鎘、錳、鉈。采用含5%氫氣的氬氣為反應(yīng)氣體，抑制了ArCl+和CaCl+的干擾。實(shí)驗(yàn)采用NIST SRM 2670和BioRad Lyphochek Urine標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)驗(yàn)證方法準(zhǔn)確度，結(jié)果顯示，方法測得兩種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中金屬元素的變異系數(shù)均小于4%。D’llio等[17]采用同樣方法結(jié)合膜去溶氣動霧化器，考察了對血清樣品中Al，Co等的含量。膜去溶氣動霧化器可以減少氧化物的生成，實(shí)驗(yàn)采用人血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和動物凍干血清進(jìn)行驗(yàn)證，測試值和標(biāo)準(zhǔn)值一致。此外，ICP-MS技術(shù)與其他技術(shù)如HPLC、HPCE、GC聯(lián)用可進(jìn)行元素的形態(tài)、分布特性等分析。HPLC-ICP-DRC-MS技術(shù)考察生物樣品中硒的形態(tài)分析，能有效解決多原子干擾的難題[18]。

2.6 生物分析方法

生物分析方法是重金屬檢測的新型技術(shù)，尤其是生物傳感器的發(fā)展，實(shí)現(xiàn)了生物和臨床樣品中痕量金屬的快速、原位檢測。酶傳感器、免疫傳感器、微生物傳感器、DNA傳感器等在重金屬檢測方面都有應(yīng)用。酶傳感器中常采用脲酶作為抑制劑測定痕量金屬。脲酶抑制法也可與薄層色譜法聯(lián)合測定重金屬含量，檢測限可達(dá) 0.02～3μg/L。Darwish 等[19]在 ELISA基礎(chǔ)上發(fā)展了一步競爭性免疫檢測法，考察了人血清中的Cd（II）。DNA傳感器作為生物傳感器領(lǐng)域的最新技術(shù)，在重金屬檢測方面表現(xiàn)良好的前景。Babkina等報(bào)道了DNA傳感器應(yīng)用于天然和飲用水、牛奶、人血清中 Pb（II），Cd（II）和 Fe（III）的檢測[20]。生物傳感器在重金屬檢測方面的良好前景不容小覷，但這一技術(shù)還在不斷探索和深入研究中，用于實(shí)際樣品，尤其是生物樣品中重金屬的檢測還不多，其基底干擾也不可忽視，需要不斷改進(jìn)。

最新研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)與某些金屬離子鍵合會改變構(gòu)象特征，這一技術(shù)也被很好地應(yīng)用到重金屬檢測中。Liu等[21]研究了5′和3′端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)的凝血酶適配子在Pb2+和Hg2+的誘導(dǎo)下，其結(jié)構(gòu)由無規(guī)卷曲狀變?yōu)镚-四股螺旋和發(fā)夾型結(jié)構(gòu)，使熒光發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。熒光下降強(qiáng)度與Pb2+和Hg2+濃度成比例關(guān)系，從而實(shí)現(xiàn)了對Pb2+和Hg2+的檢測。

3 結(jié)束語

隨著現(xiàn)代社會和工業(yè)的持續(xù)快速發(fā)展，重金屬污染防治是當(dāng)前和今后一個(gè)時(shí)期環(huán)境保護(hù)的頭等大事。重金屬檢測歷來受到重視，研究者們一直致力開發(fā)更精確、更靈敏、更快捷的檢測方法和技術(shù)。新型聯(lián)用技術(shù)在一定程度上提高了準(zhǔn)確度和靈敏度，但生物體中重金屬檢測技術(shù)仍然存在以下不足：（1）忽略了有益金屬的監(jiān)測。某些元素是人體必需的微量元素，目前的工作重點(diǎn)放在有毒有害金屬檢測上，應(yīng)該二者兼顧。（2）對重金屬元素的形態(tài)和價(jià)態(tài)分析還不夠。重金屬的生物毒性不僅與其總量有關(guān)，更大程度上由其形態(tài)分布決定。（3）忽視了樣品基底對測定的影響。許多樣品如血清、尿液，有機(jī)物含NaCl濃度較高，直接稀釋進(jìn)樣使某些元素檢出能力變差，且樣品與標(biāo)準(zhǔn)溶液的粘度差異可能成為影響方法準(zhǔn)確度的重要因素。因此，發(fā)展和使用與樣品同樣基底的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對提高方法準(zhǔn)確度尤為重要。（4）目前生物傳感技術(shù)檢測重金屬大多處于實(shí)驗(yàn)室階段，用于實(shí)際樣品的檢測還有許多關(guān)鍵技術(shù)待解決。

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