流感病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法及進(jìn)展探究

秦金勇

桂林市疾病預(yù)防控制中心，廣西桂林 542500

流感病毒又稱為：流行性感冒病毒，具有超強(qiáng)的傳染性、散播性，是一種RNA病毒，歸屬于正黏液病毒科。一般通過(guò)呼吸道感染以及人類或動(dòng)物的呼吸、講話等途徑進(jìn)行傳播。傳播的效果極快，短時(shí)間內(nèi)就可造成大面積的患有流行性感冒病毒的病例產(chǎn)生。流感病毒主要分為三個(gè)等級(jí)，即甲型、乙型、丙型。其中甲型流感病毒是一種急性的流感病毒，經(jīng)過(guò)變異發(fā)展后對(duì)人類自身的傷害巨大，死亡率較高。流感病毒實(shí)驗(yàn)室的建立在于研究流感病毒，分析和總結(jié)出流感病毒的分布范圍以及發(fā)展趨勢(shì)，對(duì)我國(guó)預(yù)防和治療流感性病毒具有至關(guān)重要的作用。

對(duì)此針對(duì)流感病毒實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)方法具有十分重要的地位。筆者結(jié)合自身的工作經(jīng)驗(yàn)，進(jìn)行如下分析。

1 檢測(cè)方法

1.1 流感病毒分離鑒定

流感病毒的分離鑒定方法主要有雞胚接種和細(xì)胞培育兩種方法，是流感病毒實(shí)驗(yàn)室最為常用的檢測(cè)方法。結(jié)合實(shí)際的案例，對(duì)兩種分離鑒定進(jìn)行詳盡闡述。

選取在2011—2012年間在該市各哨點(diǎn)監(jiān)測(cè)醫(yī)院就診患有流感病毒的病例，采集病例的鼻、咽拭子，放置在事先配置好的Eaglecs的溶液中。將標(biāo)本進(jìn)行冷藏，送入流感病毒實(shí)驗(yàn)室。在實(shí)驗(yàn)室中將標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)處理，并添加青霉素與鏈霉素保證標(biāo)本的完整，易于試驗(yàn)。在處理后的2 h內(nèi)，標(biāo)本放置在低溫冰箱中進(jìn)行冷藏。冰箱的溫度維持在-70℃左右。

①雞胚接種法。在市場(chǎng)上選取9～11日齡的雞胚和受精雞蛋，進(jìn)行雞胚接種試驗(yàn)。在雞胚的兩個(gè)雙腔中分別注入2 mL實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本分別注入三個(gè)雞胚之中。完成接種的72 h，觀察孵育情況，并維持溫度在33～35℃之間。夜晚溫度下降至4℃。于第2日，收集孵育雞的羊水以及尿液。將收集的樣本用吸管滴入血凝板中，加入1%的0型紅細(xì)胞。對(duì)樣本進(jìn)行均勻搖晃，放入觀察室中，進(jìn)行觀察。大約在30～60 min后，得出血球凝集效果，進(jìn)行分析鑒定。根據(jù)結(jié)果所呈現(xiàn)的陰陽(yáng)性進(jìn)行不同處理。如結(jié)果呈現(xiàn)為陰性，就將羊水混合采取盲傳一代。如結(jié)果呈現(xiàn)為陽(yáng)性，將采取下一步的鑒定。

②細(xì)胞接種法。將選取的樣本分別進(jìn)行細(xì)胞接種，1樣本/2接種。每個(gè)樣本接種的容量為0.2 mL。將其放置在細(xì)胞中進(jìn)行培育，溫度維持在33～35℃之間，時(shí)間長(zhǎng)度為2 h。通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞每天都會(huì)發(fā)生相應(yīng)的病變，且逐漸加深。待病變顯示為3—4加號(hào)的程度上，從中收取細(xì)胞溶液，將其放入冷藏冰箱，冰凍—融化反復(fù)2次。采取紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所呈現(xiàn)紅細(xì)胞凝聚滴度，選擇不同的處理方式。以1：8為標(biāo)準(zhǔn)，紅細(xì)胞凝聚滴度＞1：8時(shí)，將細(xì)胞溶液進(jìn)行稀釋，稀釋程度為1:10的比例。稀釋完成后，進(jìn)行傳代處理；紅細(xì)胞凝聚滴度＜1:8時(shí)，直接進(jìn)行傳代處理。最后進(jìn)行鑒定，并將結(jié)果交至國(guó)家流感病毒控制中心。

這兩種流感病毒分離鑒定方便各有利弊。雞胚接種法操作簡(jiǎn)單、方便，且對(duì)病毒原體的要求度不高，檢出效率較低；細(xì)胞培養(yǎng)法操作較難，花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，但檢出效率較高。同時(shí)，兩種分離鑒定方法的靈敏度好、特異性強(qiáng)，常用于流感病毒的分離檢測(cè)之中。

1.2 免疫學(xué)檢測(cè)方法

免疫學(xué)檢測(cè)方法是依據(jù)免疫學(xué)的理論，對(duì)抗原、抗體、免疫細(xì)胞分子、分泌細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)手段，廣泛用于流感病毒的檢測(cè)。一般針對(duì)抗體的檢測(cè)，選擇病例的血清樣本；針對(duì)抗原的檢測(cè)，選擇病例的呼吸道溶液的樣本。

①血清的檢測(cè)。血清診斷主要用于抗體的檢測(cè)，方法較多，如：血凝抑制方法、中和方法、酶免疫方法、補(bǔ)體結(jié)合方法等類型。我國(guó)普遍采取的血凝抑制方法進(jìn)行動(dòng)態(tài)的血清診斷，同時(shí)，針對(duì)雙份血清可同時(shí)進(jìn)行檢驗(yàn)。如樣本的特異性抗體表現(xiàn)為4倍以上增高，就可初步診斷為流感病毒。

②抗原的檢測(cè)?？乖瓩z測(cè)主要針對(duì)甲型流感病毒的檢測(cè)，其中包含快速檢測(cè)甲型流感病毒方法以及流感病毒斑點(diǎn)酶的吸附方法?？焖贆z測(cè)甲型流感病毒方法強(qiáng)調(diào)的是根據(jù)病例的鼻、咽拭子的樣本，利用金標(biāo)記的免疫層分析方法，從中取病體抗原，進(jìn)行詳細(xì)檢測(cè)。所需時(shí)間較短，僅需要30 min就可以確定流感病毒的類型。這是基于我國(guó)2009年大范圍發(fā)生甲型流感病毒所從中研究得出的成果。同時(shí)，流感病毒斑點(diǎn)酶的吸附方法也廣泛應(yīng)用于對(duì)甲型流感的檢測(cè)，主要利用甲型流感的兩種抗體不同，將其分成檢測(cè)抗體和捕獲抗體，從中得出檢測(cè)結(jié)果。

免疫學(xué)檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度較高，特異功能強(qiáng)，具有廣泛的應(yīng)用性。但免疫學(xué)檢測(cè)的方法對(duì)選取的樣本要求較高，且分析的因素較多。

1.3 核酸檢測(cè)方法

核酸檢測(cè)主要指的是一種直接檢測(cè)流感病毒病原體核酸狀況的方法，這是基于不能檢測(cè)抗體和抗原的基礎(chǔ)上，所進(jìn)行的一種急性檢測(cè)。其中包括對(duì)核酸本身的提取、擴(kuò)增以及檢測(cè)。這種檢測(cè)方法主要強(qiáng)調(diào)了對(duì)患者自身基因狀況的檢測(cè)。通過(guò)提取患者的基因，將利用引物以及相關(guān)的技術(shù)對(duì)所提取的基因進(jìn)行復(fù)制和擴(kuò)大。其中，引物專門指的是可能會(huì)發(fā)生突變以及可以對(duì)其識(shí)別的基因。根據(jù)基因序列診斷方法、酶切方法等方式對(duì)基因中的病毒組織和病毒結(jié)構(gòu)進(jìn)行判斷，從而發(fā)現(xiàn)患者的血液里是否有病毒體的基因，進(jìn)而判斷流感病毒的類型以及發(fā)病程度。其中，檢測(cè)方法主要有基因測(cè)序方法、逆轉(zhuǎn)錄PCR、熒光定量PCR等。

核酸檢測(cè)方法具有檢測(cè)速度快，特異性強(qiáng)、敏感度高的特點(diǎn)，一般基于未能檢測(cè)抗體和抗原的情況下。但是核酸檢測(cè)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室的操作環(huán)境、操作設(shè)備以及操作人員的要求相對(duì)較高，這也決定了核酸檢測(cè)所花費(fèi)的成本較高，一般適合科研機(jī)構(gòu)、衛(wèi)生疾控系統(tǒng)及較大醫(yī)院的流感病毒實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)，對(duì)于較小醫(yī)院還是采用以上的幾種檢測(cè)方法。

2 小結(jié)

隨著我國(guó)醫(yī)療水平的不斷提高，針對(duì)流感病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)也隨之提高。其中，由雞胚接種和細(xì)胞接種的病毒分離鑒定方法是我國(guó)目前最為常用的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段，其操作簡(jiǎn)單，費(fèi)用較低，靈敏度高，特異性強(qiáng)的特點(diǎn)受到了衛(wèi)生疾控系統(tǒng)和各大中小醫(yī)院流感病毒實(shí)驗(yàn)室的歡迎，是我國(guó)主流的檢測(cè)技術(shù)。但對(duì)于急性流感病毒的檢測(cè)具有一定程度的弊端，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，影響檢測(cè)的效果，從而延誤了病情的診斷和治療。免疫學(xué)檢測(cè)方法正好彌補(bǔ)了這一缺陷，具有花費(fèi)時(shí)間短、靈敏度高等特點(diǎn)，但其中分為血清和抗原兩種檢測(cè)手段，每種檢測(cè)的方法的優(yōu)缺點(diǎn)有所不同。血清檢測(cè)時(shí)間短、快速便捷、靈敏度低；抗原檢測(cè)靈敏度高、花費(fèi)成本高。另外，核酸檢測(cè)是針對(duì)缺乏抗體和抗原的情況下，針對(duì)基因的檢測(cè)，但其高成本、高要求使得中小型醫(yī)院望而卻步。

通過(guò)以上幾種檢測(cè)方法的分析，我們看到了我國(guó)在流感病毒實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)方法中逐步前進(jìn)和發(fā)展，并取得了一定的成效，促進(jìn)了我國(guó)對(duì)流感病毒的檢測(cè)和管理，有利于分析流感趨勢(shì)，預(yù)防流感發(fā)生，并真正將流感病毒的快速檢測(cè)、型別的鑒定、流行趨勢(shì)的分析等技術(shù)應(yīng)用到流感的預(yù)防控制及患者治療中，為廣大患者盡快解決病痛，實(shí)現(xiàn)社會(huì)主義醫(yī)療事業(yè)的穩(wěn)固發(fā)展。

[1] 馬輯紅，何華，高楓，等.流感病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的比較和改進(jìn)[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2006（9）：1131.

[2] 劉佳，柳敏，顧兵，等.甲型H1N1流感病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].臨床檢驗(yàn)雜志，2011（3）：214-215.

[3] 竇文霞，褚國(guó)方，李明珠，等.流感病毒快速檢測(cè)方法與傳統(tǒng)方法的比較[J].職業(yè)與健康，2009（6）：599-600.