脂肪干細(xì)胞生物學(xué)特性研究及損傷修復(fù)應(yīng)用進(jìn)展

呂愛紅 劉廣益 王巧稚

脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是從脂肪組織中分離獲得的一種具有自我更新及多向分化潛能的干細(xì)胞。2001年，Zuk等［1］通過吸脂術(shù)從人體脂肪懸液中首次分離獲得，并發(fā)現(xiàn)特定條件下可以向肌肉、軟骨、脂肪、表皮，造血、神經(jīng)等多種組織分化。脂肪組織和骨髓一樣都來源于中胚層，Ugarte等［2］發(fā)現(xiàn) ADSCs與骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)在細(xì)胞形態(tài)、生長動力學(xué)、細(xì)胞衰減、多向分化能力及基因轉(zhuǎn)導(dǎo)能力等方面基本相似。ADSCs具有取材容易、創(chuàng)傷小、細(xì)胞增殖快、不會引起倫理學(xué)爭議等優(yōu)點(diǎn)。因此，它成為醫(yī)學(xué)工作者研究的熱點(diǎn)。本文就脂肪干細(xì)胞的生物學(xué)特性及應(yīng)用進(jìn)展作一綜述。

1.脂肪干細(xì)胞的生物學(xué)特性

1.1 形態(tài)特征 原代培養(yǎng)的ADSCs，(2～4)小時后開始貼壁，24小時完成貼壁，細(xì)胞呈圓形或梭形，，體積小，核漿比例大，隨后細(xì)胞體積增大，克隆形成并有突起伸出。經(jīng)過傳代，圓形細(xì)胞減少，梭形細(xì)胞增多，呈平行排列或漩渦樣生長。Colter認(rèn)為形態(tài)較小的ADSCs增值能力強(qiáng)，克隆率高，而較大的成熟基質(zhì)細(xì)胞，增殖能力和克隆率較低。隨著傳代次數(shù)增加，細(xì)胞形態(tài)和排列趨于一致［3］。

1.2 生長周期 細(xì)胞周期分析顯示:G0/G1期的細(xì)胞占69%，S期細(xì)胞占24%，G2/M期細(xì)胞占8%，提示脂肪干細(xì)胞具有較強(qiáng)的再生能力［4］。核型分析顯示，多次傳代后，ADSCs仍具有正常的二倍體核型，且不隨傳代次數(shù)增加而發(fā)生改變，這說明ADSCs具有遺傳穩(wěn)定性。ADSCs倍增時間平均約為60小時。

1.3 免疫表型 目前為止，還未明確ADSCs的特異性抗原標(biāo)記。與MSCs一樣，ADSCs表達(dá)CD44，CDl05，STRO－l，CD117和CDl66等間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)志分子［5］不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)志分子 CD34、CD45、CD45、CD80。此外，ADSCs還表達(dá)黏附分子CD29，CD44和CD49。CD29對血管發(fā)生具有重要作用，CD44在細(xì)胞外基質(zhì)的發(fā)育中起關(guān)鍵作用;CD49參與纖連蛋白的細(xì)胞黏附［6］。雖然ADSCs和MSCs表達(dá)的基本標(biāo)志是相同的，但也存在一些細(xì)微的差異。如 ADSCs表達(dá)CD49d，不表達(dá)CDl06(VCAM－1);而MSCs恰好相反，或許這可以作為區(qū)分MSCs和ADSCs的一個標(biāo)志［7］。由于ADSCs不表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ和人白細(xì)胞DR抗原，最近有研究表明ADSCs能通過作用于機(jī)體的樹突狀細(xì)胞發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用，參與誘導(dǎo)機(jī)體的免疫耐受，并且當(dāng)ADSCs與異基因外周血細(xì)胞共同培養(yǎng)時，不能刺激混合淋巴細(xì)胞的反應(yīng)，這表明ADSCs可用于異體移植［8］。

1.4 ADSCs多向分化潛能 研究證明脂肪干細(xì)胞在不同誘導(dǎo)因子的誘導(dǎo)下，能夠向脂肪、軟骨、成骨、成肌等多個細(xì)胞系分化，此為縱向分化［10］。相應(yīng)地，有實(shí)驗(yàn)研究證明，脂肪干細(xì)胞還可向神經(jīng)細(xì)胞，肝細(xì)胞分化，即橫向分化［11］。Guilak等［12］分離培養(yǎng)人脂肪干細(xì)胞，并通過套環(huán)法獲得45個單細(xì)胞克隆并傳至第四代，然后分別將其向脂肪、骨、軟骨和神經(jīng)方向誘導(dǎo)，結(jié)果表明81%的單細(xì)胞克隆至少可以分化為其中的一種細(xì)胞，52%的可以分化為兩種或兩種以上類型的細(xì)胞，分化為骨、軟骨、脂肪和神經(jīng)樣細(xì)胞的比率分別為48%、43%，52%和12%。以上證明了成體干細(xì)胞是一類具有多向分化潛力的干細(xì)胞，尤其向神經(jīng)細(xì)胞方向的分化，有力地說明成體干細(xì)胞具有跨胚層的橫向分化能力。近年來隨著對ADSCs研究的不斷深入，也出現(xiàn)了許多新的問題，例如有研究發(fā)現(xiàn)，來源于不同個體、不同部位的ADSCs的分化能力有明顯差別［13］，具體原因仍不清楚。

2.應(yīng)用進(jìn)展

2.1 ADSCs促進(jìn)創(chuàng)面愈合 燒傷、創(chuàng)傷、糖尿病等引起的皮膚缺損，臨床常規(guī)治療方法效果欠佳，干細(xì)胞作為種子細(xì)胞為皮膚缺損的修復(fù)重建提供了新的途徑。Yuan等［14］將ADSCs與角朊細(xì)胞共同培養(yǎng)確定為實(shí)驗(yàn)組，進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，建立創(chuàng)傷模型，比較24小時、48小時和72小時后角朊細(xì)胞遷徙距離證實(shí)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組角朊細(xì)胞遷徙明顯快于對照組，并認(rèn)為ADSCs通過直接接觸促進(jìn)表皮角朊細(xì)胞遷移;對各組角朊細(xì)胞數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組角朊細(xì)胞增殖速度高，差異有顯著性意義，說明ADSCs可促進(jìn)角朊細(xì)胞增殖和遷移。

Lu等［15］通過在小鼠背部皮瓣基底局部注射等量的ADSCs后7天，分析背部皮瓣血管密度和單位組織內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量最大，認(rèn)為ADSCs有促進(jìn)血管重建功能。Nambu等［16］將自體脂肪組織干細(xì)胞移植于糖尿病病鼠類動物創(chuàng)面的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面上皮形成，肉芽組織較對照組好，毛細(xì)血管更豐富。

薛君等［17］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ADSCs可通過增殖分化促進(jìn)創(chuàng)面愈合。Altman等［18］以絲蛋白－殼聚糖為載體將綠色熒光蛋白1標(biāo)記的ADSCs移植于鼠類創(chuàng)面，術(shù)后8天實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面愈合面積較對照組大，術(shù)后2周實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面部位血管密度高于對照組，成纖維熱休克蛋白、平滑肌肌動蛋白和Von Willbrand因子綠色熒光蛋白標(biāo)記陽性。并可見ADSCs分化成上皮細(xì)胞。ADSCs也能通過旁分泌作用于成纖維細(xì)胞，促進(jìn)其分泌I、Ⅲ型膠原和纖連蛋白，促進(jìn)皮膚表皮細(xì)胞的成熟以利于創(chuàng)面愈合和瘢痕縮?。?9］。上述研究表明脂肪組織在創(chuàng)面愈合過程中起著關(guān)鍵作用。

2.2 ASDCs和器官修復(fù) Panat-Bernard等人在半固體培養(yǎng)基甲基纖維素中培養(yǎng)鼠類脂肪來源的細(xì)胞，并添加重組的造血生長因子，經(jīng)過3周培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)簇狀的自發(fā)搏動的細(xì)胞，并檢測電生理學(xué)、藥理學(xué)和亞顯微結(jié)構(gòu)的特性，顯示與心肌細(xì)胞分化相同［20］研究人員在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，通過血管注射脂肪干細(xì)胞可修復(fù)受到冰凍傷害的左心室，并在2周后檢測到了供體來源的細(xì)胞。這些細(xì)胞表達(dá)心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5，troponinI和肌球蛋白重鏈，與心肌細(xì)胞相一致［21］。Miyahara等［22］將ASDCs制成細(xì)胞單層薄片直接移植到心肌梗死區(qū)域，移植后細(xì)胞層增厚，并有一部分細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞，修補(bǔ)變薄的心臟壁，改善了心臟功能。Hironori等［23］發(fā)現(xiàn)ADMSCs高表達(dá)VEGF、HGF等生長因子，這些生長因子可改善心肌血液灌注，降低心室擴(kuò)張和重構(gòu)心室。由此說明，ASDCs是治療心肌梗死理想的移植細(xì)胞來源。

SEO等［24］將加入 DMSO、HGF和OSM 誘導(dǎo)的 ADSCs從尾靜脈輸入由四氯化碳造成肝損傷的SCID小鼠體內(nèi)，觀察到在體內(nèi)轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞能產(chǎn)生清蛋白。TALeNS－VISCONTI等［25］將從人吸脂術(shù)中分離得到的ADSCs經(jīng)體外誘導(dǎo)后，觀察到轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞表面表達(dá)CDl3、CD90和CDl05，通過RTPCR檢測細(xì)胞內(nèi)有CKl8、CKl9、清蛋白、細(xì)胞色素2El、增強(qiáng)子結(jié)合蛋白8等的基因表達(dá)，提示ADSCs能向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化。國內(nèi)研究研究實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)脾動脈移植ASDCs后肝硬化大鼠模型的血清白蛋白水平提高、血清的總膽紅素水平降低、肝灌注量及肝細(xì)胞的變性和壞死得到改善［26］。Fang等［27］認(rèn)為ASDCs極有可能分化為膽管細(xì)胞，參與假小葉的改造與重建，從而達(dá)到抗肝纖維化的目的。

此外，利用ASDCs分化為平滑肌的能力，可對受損膀胱進(jìn)行修復(fù)與重建。楊進(jìn)等［28］TGF－β1誘導(dǎo)ASDCs后，RTPCR結(jié)果顯示細(xì)胞表面表達(dá)α肌動蛋白、Calpolin，Sm22，MHC表型無表達(dá)，α肌動蛋白為平滑肌細(xì)胞特異性表達(dá)物［29］。上述研究表明，ASDCs細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)為心臟、肝臟、胰腺、膀胱等臟器疾病的治療提供了新的可能性。

2.3 ADSCs和骨髓移植 目前，骨髓移植存在的最大問題就是供體缺乏，但ADSCs聯(lián)合骨髓移植可以彌補(bǔ)單獨(dú)骨髓移植的不足。ADSCs和BMSCs具有相同的黏附分子，如CD9，CD29、CD49，也可分泌相同的細(xì)胞因子，如 M －CSF、TNF－a、IL－6、IL－7和SCF。當(dāng)脂肪來源的成體干細(xì)胞和造血干細(xì)胞共同培養(yǎng)時，可增加CD34+造血干/祖細(xì)胞的增殖、分化和活性，促進(jìn)造血系統(tǒng)重建［30］。Zhu等［31］認(rèn)為脂肪來源的干細(xì)胞能分泌DKK－1，抑制腫瘤細(xì)胞K562的增殖。王健民等［32］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MSC體外能夠抑制不同來源的白血病細(xì)胞增殖，促進(jìn)白細(xì)胞早期調(diào)亡。由此說明，ADSCs可能輔助或替代骨髓移植治療。

2.4 基因治療的載體 ADSCs的獲取及體外分離培養(yǎng)比較簡單，擴(kuò)增容易，且易被外源性基因轉(zhuǎn)染。因此，與造血干細(xì)胞相比，ADSCs是一種更為理想的基因治療的靶細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，體外培養(yǎng)的ADSCs經(jīng)過介導(dǎo)，易導(dǎo)入外源性基因，在體內(nèi)長期，高效地表達(dá)。Kueerova等［33］利用ADSCs作為藥物細(xì)胞載體，通過其“歸巢”作用成功抑制了小鼠黑色素瘤的生長。由此說明，ADSCs是未來基因治療的一個非常重要的工具。

3.問題

雖然脂肪源性干細(xì)胞的研究已取得了很大的進(jìn)展，但依然存在著一些問題:①ADSCs特異性標(biāo)記物尚未確定。②體外分離培養(yǎng)時如何獲得純度較高的ADSCs，尚缺少統(tǒng)一的分離培養(yǎng)純化模式。③ADSCs雖然可以在不同誘導(dǎo)條件下向多種組織分化，但目前這些分化誘導(dǎo)的機(jī)制仍不清楚。④移植外源性ADSCs仍具有一定的免疫源性，因此如何降低免疫源性仍顯得很重要。⑤ADSCs大量擴(kuò)增和長期分化過程中是否引起癌性危害，需要進(jìn)一步的研究實(shí)驗(yàn)證實(shí)。⑥ADSCs治療研究目前仍以動物實(shí)驗(yàn)為主，缺乏大量的臨床實(shí)驗(yàn)。但是，隨著對干細(xì)胞生物學(xué)特性的認(rèn)識不斷加深和干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷進(jìn)步，相信不久的將來，以成體干細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞工程和組織工程技術(shù)將會逐步發(fā)展成為新的臨床治療模式，為一些難治性疾病治療帶來新的希望。

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