基于分子動(dòng)力學(xué)模擬研究P53-DNA結(jié)合域單點(diǎn)突變對(duì)肽段的影響

許朝瑩

（山東師范大學(xué)物理與電子科學(xué)學(xué)院 山東 濟(jì)南 250014）

0 引言

P53作為最重要的抑癌基因之一，與癌癥的發(fā)生發(fā)展聯(lián)系緊密，大約50%的人類癌癥中存在著P53突變。P53定位于人類17p13.1染色體上，由11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子組成，能編碼與核DNA結(jié)合的磷蛋白P53。人類P53蛋白由393 個(gè)氨基酸組成，有三個(gè)功能區(qū):（1）N 端區(qū)域(1～94)；（2）中間疏水區(qū)域 (94～297，DNA Binding Domain，DBD)；（3）C 端區(qū)域(297～393)。DBD區(qū)域能直接與DNA結(jié)合，絕大多數(shù)腫瘤中檢查到的P53突變即發(fā)生在該區(qū)域中，由兩個(gè)反平行折疊片構(gòu)成一個(gè)三明治樣的片層骨架結(jié)構(gòu)。該區(qū)域有四個(gè)保守區(qū)域，分別記為Ⅱ-Ⅴ。Ⅳ(234-255)能直接和DNA結(jié)合，單獨(dú)存在時(shí)沒(méi)有嚴(yán)格的二級(jí)結(jié)構(gòu)，呈無(wú)規(guī)則卷曲狀。迄今為止，對(duì)P53區(qū)域Ⅳ突變結(jié)構(gòu)及生理功能缺乏深入系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)，對(duì)該肽段與腫瘤致病微觀機(jī)制的聯(lián)系尚不清楚。

P53蛋白殘基的點(diǎn)突變、缺失以及失活在癌癥的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵性的作用。Assaf Friedler等用NMR技術(shù)研究R249S突變對(duì)P53結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)突變體的結(jié)構(gòu)與野生態(tài)結(jié)構(gòu)類似，但是β三明治片層骨架結(jié)構(gòu)的柔性增加，DNA結(jié)合平面發(fā)生局部彎曲。Oded Suad等利用實(shí)驗(yàn)檢測(cè)R249S、R249S/H168R和R249S/H168R/T123A突變對(duì)P53轉(zhuǎn)活功能的影響，發(fā)現(xiàn)R249S突變使DBD區(qū)域結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，與DNA、蛋白質(zhì)之間的相互作用消失；R249S/H168R突變能穩(wěn)定P53-DNA結(jié)構(gòu)，能部分恢復(fù)P53的轉(zhuǎn)活功能；R249S/H168R/T123A突變進(jìn)一步增強(qiáng)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

盡管實(shí)驗(yàn)生物學(xué)對(duì)P53突變作了大量研究和統(tǒng)計(jì)，對(duì)R249殘基突變影響P53結(jié)構(gòu)也進(jìn)行了一些研究。但是，在原子水平，P53蛋白及其突變區(qū)域的構(gòu)象如何變化？與腫瘤致病微觀機(jī)制有何聯(lián)系？尚沒(méi)見到有關(guān)報(bào)道。本文利用分子動(dòng)力學(xué)模擬方法，研究R249S突變對(duì)P53-DNA結(jié)構(gòu)的影響。分別對(duì)野生型wtP53肽段和單點(diǎn)突變P53-R249S進(jìn)行獨(dú)立的分子動(dòng)力學(xué)模擬，每組模擬300ns。該研究為從分子層次認(rèn)識(shí)腫瘤的致病機(jī)制和設(shè)計(jì)新的治癌藥物奠定理論基礎(chǔ)。

1 方法

P53蛋白的R249殘基位于DBD保守Ⅳ區(qū)域（殘基234-255），選取殘基230-258肽段作為研究對(duì)象。分別對(duì)wtP53肽段和單點(diǎn)突變P53-R249S肽段兩個(gè)體系進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，wtP53肽段的初始結(jié)構(gòu)取自蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（代碼為1tsr），R249S突變利用Swiss-pdbviewer軟件實(shí)現(xiàn)。

利用GROMOS軟件和43A1力場(chǎng)，分別對(duì)上述體系在NTP系綜下進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬。帶電基團(tuán)選用殘基在pH值為7.2下的質(zhì)子化狀態(tài)，選用SPC水模型，選擇周期性大小合適的十二面體盒子，溶質(zhì)同盒子邊緣最小間距設(shè)定為0.8nm。靜電作用力用PME計(jì)算，其庫(kù)倫力閾值定為0.9，范德華相互作用力的勢(shì)能距離閾值定為0.9。為使模擬體系保持電中性，wtP53肽段體系加入一個(gè)氯離子，P53-R249S體系呈現(xiàn)電中性，不加任何離子。能量?jī)?yōu)化后，約束溶質(zhì)原子，進(jìn)行300ps的約束動(dòng)力學(xué)模擬，將體系溫度由50K平衡升到300K。使體系均保持在溫度300K、壓強(qiáng)1bar，采用弱耦合作用保持體系的溫度和壓強(qiáng)穩(wěn)定，溫度和壓強(qiáng)的耦合時(shí)間常數(shù)均為0.1ps，模擬步長(zhǎng)為2fs，進(jìn)行300ns的自由動(dòng)力學(xué)模擬，每2ps采集一次構(gòu)象。

2 結(jié)果與討論

為深入探索生理環(huán)境條件不同殘基突變對(duì)P53肽段構(gòu)象穩(wěn)定性的影響，我們計(jì)算二組體系的自由能分布和聚類情況。

利用GROMACS的兩個(gè)程序g_covar和g_anaeig對(duì)模擬構(gòu)象進(jìn)行主成分分析，選取兩個(gè)最大主量PC1和PC2為反應(yīng)坐標(biāo)，根據(jù)構(gòu)象分布，用二維直方圖法分別計(jì)算二個(gè)體系的自由能。自由能定義為-kTlnP(PC1,PC2)，其中，k和T分別為波爾茲曼常數(shù)和溫度，P（PC1,PC2）為兩個(gè)主量的聯(lián)合概率分布。在圖中，顏色越深，表明相應(yīng)自由能越低、結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，構(gòu)象落到該區(qū)域的概率就越大。不同殘基突變對(duì)結(jié)構(gòu)有不同的影響。單點(diǎn)突變型P53-R249S肽段的自由能較低，而野生型P53肽段有一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的中間態(tài)結(jié)構(gòu)。

對(duì)體系進(jìn)行構(gòu)象聚類(Conformation clusters)分析，確定采樣構(gòu)象的傾向。構(gòu)象聚類基于構(gòu)象之間骨架原子位置的根均方差(Root mean square deviation,RMSD)。在模擬最后100ns輸出的軌跡中，等間隔均勻選取1×104個(gè)構(gòu)象作為分析對(duì)象，基于構(gòu)象之間的根均方差進(jìn)行聚類。聚類的標(biāo)準(zhǔn)是，如果一個(gè)構(gòu)象同某個(gè)類里面的任一構(gòu)象之間的根均方差小于0.1nm，那么這個(gè)構(gòu)象就屬于該類。通過(guò)聚類發(fā)現(xiàn)，單點(diǎn)突變型P53-R249S肽段的中心構(gòu)象有α螺旋結(jié)構(gòu)，而野生型P53肽段只有β片結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論

P53殘基突變是腫瘤病發(fā)的重要因素。為了研究R249S突變對(duì)結(jié)構(gòu)的影響，本文選取P53殘基230-258肽段為對(duì)象，利用分子動(dòng)力學(xué)模擬研究其突變對(duì)P53肽段的影響。采用GROMACS軟件包、43A1力場(chǎng)和充分含水模型，在生理?xiàng)l件下分別對(duì)肽段wtP53和單點(diǎn)突變P53-R249S進(jìn)行300ns的獨(dú)立分子動(dòng)力學(xué)模擬，研究R249S突變對(duì)結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明:單點(diǎn)突變P53-R249S肽段自由能較低，無(wú)中間態(tài)，而野生型P53肽段有一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的中間態(tài)。從原子水平上揭示單點(diǎn)突變P53-R249S肽段和wtP53肽段構(gòu)象差異的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)特性，能更好地理解由P53殘基突變引起肝癌的微觀致病機(jī)制，為新藥物設(shè)計(jì)提供啟迪。

［1］Attardi,L.D.;Donehower,L.A.Mutat Res.2005,576(1-2),4.

［2］Soussi,T.Adv Cancer Res.2011,110,107.