利用甲醇廠CO2 尾氣培養(yǎng)小球藻*

陳霖，李林聲，王明茲，李興龍，鄭行，陳必鏈

1(福建師范大學 工業(yè)微生物教育部工程研究中心，福建 福州，350108)2(福建師范大學生命科學學院，福建 福州，350108)3(江蘇索普集團有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江，212000)4(福清市新大澤螺旋藻有限公司，福建 福清，350300)

近年頻發(fā)的全球溫度升高、海平面上升、洪水泛濫和暴風雨等極端災害性氣候都與溫室氣體的過量排放密切相關(guān)，由此引起的生態(tài)系統(tǒng)的改變將嚴重影響人類的各項活動。其中電廠、水泥廠等工業(yè)鍋爐的煙道尾氣是CO2等溫室氣體的主要排放源［1］。在諸多控制大氣污染的技術(shù)中，微藻生物技術(shù)固定CO2被認為是一種經(jīng)濟高效和具有前景的新方法［2］。采用工業(yè)煙道氣替代純凈CO2作為微藻生長的碳源，將大大降低微藻生產(chǎn)成本，同時又能夠降低煙道氣CO2的環(huán)境排放量，對于減緩溫室效應和控制全球變暖具有重要意義［3］。

目前國內(nèi)外對利用微藻進行CO2尾氣吸收和利用的研究集中在火電廠、水泥廠和酒精發(fā)酵車間等的煙道氣［4-8］，但是對甲醇廠排放的高濃度CO2尾氣進行研究的文章尚未見報道。江蘇索普集團有限公司甲醇廠所產(chǎn)生的高濃度CO2尾氣每年有1.8 ×105t 用于生產(chǎn)醋酸，但仍有7.4 ×105t CO2直接排向大氣，增加環(huán)境壓力。小球藻為綠藻門單細胞藻類，光合效率高，富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素、葉黃素、蝦青素和多種維生素，具有較高的營養(yǎng)價值和提高免疫力的功能;它是國內(nèi)外用于研究CO2固定的常用微藻種類，如Borkenstein［6］等用小球藻固定水泥廠尾氣CO2的效果與利用純凈的CO2進行培養(yǎng)時的效果基本相當;Douskova［9］等利用小球藻固定CO2含量為10% ～13%的工業(yè)尾氣時效果比利用純凈的CO2培養(yǎng)時的效果更好，同時還降低了生產(chǎn)成本;Matsukawa［10］等利用小球藻固定CO2的同時獲得較高含量的抗氧化劑;Keller［11］等利用小球藻脫除空氣中的CO2，脫除速率達到63.9 g/(m3·h);高春燕［12］等利用小球藻在光生物反應器中脫除空氣中的CO2，其脫除CO2的能力約為118 g/(m3·h)。本文利用江蘇索普集團有限公司甲醇廠所產(chǎn)生的高濃度CO2尾氣作為碳源并結(jié)合不同的通氣和培養(yǎng)方式培養(yǎng)小球藻，為以甲醇廠CO2尾氣為碳源的微藻規(guī)模化養(yǎng)殖奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藻種

小球藻(Chlorella sp. )由福建省福清市新大澤螺旋藻有限公司提供。

1.2 CO2 尾氣

CO2尾氣直接來源于江蘇索普集團有限公司甲醇廠生產(chǎn)車間排放的高濃度CO2尾氣，尾氣氣體組成為:99.13% CO2、0.65% O2和0.22% CO。

1.3 小球藻的培養(yǎng)和實驗條件設(shè)置

將生長至對數(shù)生長期的藻種接種到1 L 的三角燒瓶中，裝液量為800 mL，起始OD 約為0.150，培養(yǎng)溫度(26 ±1)℃，光照由3 組30 W 熒光燈提供，光照強度約為3 000 lux，光暗周期為24 h∶0 h。

進行CO2濃度對小球藻生長的影響實驗時，高濃度CO2尾氣通過微型空氣泵和氣體流量計配成CO2濃度分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%和純尾氣的氣體，以通空氣組為對照組，通氣流速均為300 mL/min。每個處理均設(shè)置2 個平行樣，下同。

進行氣體流速實驗時，保持培養(yǎng)溫度、光照強度和裝液量不變，通入CO2濃度為10%的混合氣體，氣體流速設(shè)置為200、300、400 和500 mL/min，以300 mL/min 空氣組做對照。

進行通氣方式實驗時，保持培養(yǎng)溫度、光照強度和裝液量不變，通入CO2濃度為10%的混合氣體，通氣方式分別采用連續(xù)、間歇和遞增通氣3 種方式。間歇通氣方式設(shè)置為5、10、20 和30 min/h;連續(xù)通氣為持續(xù)通氣;遞增通氣方式設(shè)置為每兩天遞增10 min/h，起始通氣流速為5 min/h。

進行分批補料培養(yǎng)實驗時，保持培養(yǎng)溫度、光照強度和裝液量不變，通入CO2濃度為10%的混合氣體，通氣速率為300 mL/min。培養(yǎng)基中的氮源(尿素)和磷源(KH2PO4)采用流加方式添加，其余營養(yǎng)物質(zhì)基礎(chǔ)料中投入。尿素和KH2PO4的起始添加量分別設(shè)置為總量的30%、40%、50%和60%，從培養(yǎng)第3 天開始流加，連續(xù)流加4 天。以一次性投入全部氮源和磷源的分批培養(yǎng)為對照。

進行半連續(xù)培養(yǎng)實驗時，保持培養(yǎng)溫度、光照強度和裝液量不變，通入CO2濃度為10%的混合氣體，通氣速率為300 mL/min。當小球藻生長到對數(shù)期末期時開始進行半連續(xù)培養(yǎng)，更新周期為24 h，更新率R 設(shè)置為10%、20%、30%、40%、50%。

進行冰醋酸實驗時，保持培養(yǎng)溫度、光照強度和裝液量不變，通入CO2濃度為10%的混合氣體，通氣速率為10 mL/min。進行一次性添加和流加試驗，一次性添加冰醋酸濃度分別為0 μL/L、50 μL/L、75 μL/L、100 μL/L、125 μL/L 和150 μL/L。以通空氣并不添加冰醋酸組為對照。流加冰醋酸試驗，冰醋酸流加量分別為10、15、20、25 μL/(L·d)和一次性添加100 μL/L 的分批培養(yǎng)，連續(xù)添加5 d，以通入300 mL/min 空氣并不添加冰醋酸組為對照。

1.4 藻細胞干重測定

將15 mL 小球藻液加入烘干至恒重的離心管中，4 000 r/min 離心15 min，倒去上清液，用蒸餾水清洗2 次，離心所得藻泥敞口放置于80 ℃烘箱，約烘至恒重，每個梯度3 個重復樣，稱重后取平均值。

1.5 比生長速率的測定

比生長速率μ(d-1)的計算:

其中，X1和X0分別指培養(yǎng)結(jié)束和起始細胞濃度(g/L);t1和t0分別指培養(yǎng)結(jié)束和開始的時間(d)。

1.6 生產(chǎn)率(biomass productivity)［g/(L·d)］的測定［13］

生產(chǎn)率的計算:

其中，X1和X0分別指培養(yǎng)結(jié)束和起始細胞濃度(g/L);t1和t0分別指培養(yǎng)結(jié)束和開始的時間(d)。

1.7 日采收量(Y)和產(chǎn)率(P)的測定［13］

其中，V 為培養(yǎng)液總體積;R 為更新率;C 為細胞濃度(g/L)。

其中，Y'為總采收量;V 為培養(yǎng)液總體積;R 為更新率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同CO2 濃度對小球藻生長的影響

小球藻在通入較高CO2濃度氣體的條件下具有較好的耐受性并且能夠正常生長，具體見表1。由表1 可知，小球藻可以在CO2濃度為80%條件下生長。而通入100%的高濃度CO2尾氣時則完全抑制小球藻的生長并且在培養(yǎng)2 d 后死亡，并且在培養(yǎng)的第1天pH 值下降至4.9(圖1 未顯示)，這可能是由于通入的CO2濃度過高導致培養(yǎng)液的pH 下降太多從而抑制小球藻的生長。而通入其他濃度的CO2雖然在培養(yǎng)初期也會有所抑制，但是隨著培養(yǎng)時間的延長和小球藻濃度的增加，小球藻對環(huán)境pH 逐步適應，培養(yǎng)幾天后抑制作用逐漸減弱。在10% CO2濃度下生長最快且生物量最高，因此選用10% CO2作為后續(xù)實驗的濃度。

通入不同CO2濃度的氣體對培養(yǎng)液pH 的影響較大(圖1)。圖1 顯示，CO2導致培養(yǎng)液pH 下降，在培養(yǎng)初期尤其嚴重，通入的CO2濃度越高pH 值下降越大，隨著培養(yǎng)時間的延長，小球藻對CO2利用量的增加，pH 值開始緩慢上升，培養(yǎng)10 d 后通10% CO2組的pH 升至中性左右，而通空氣的對照組pH 值基本維持在7 左右。

表1 不同濃度CO2 通氣對小球藻生長的影響

圖1 不同CO2 濃度通氣對培養(yǎng)液pH 值的影響

2.2 CO2 流速對小球藻生長的影響

CO2氣體流速對小球藻生長的影響見圖2。由圖2 可知，當CO2氣體流速為300 mL/min 時，小球藻生物量達到最高為0.502 g/L，而500 mL/min 時獲得生物量最低，僅為0.409 g/L。

圖2 CO2 流速對小球藻生長的影響

2.3 通氣方式對小球藻生長的影響

圖3 表明不同通氣方式對小球藻生長的影響較為明顯，由圖3 可以看出，當采用10 min/h 的通氣方式下獲得生物量和產(chǎn)率分別為0.681 g/L 和0.082 g/(L·d)，為連續(xù)通氣組的1.42 倍和1.44 倍;其次是遞增通氣方式獲得較高生物量為0.667 g/L，連續(xù)通氣下獲得生物量和產(chǎn)率略高于對照組。當采用10 min/h 時通入的CO2能夠在培養(yǎng)的前5 天滿足小球藻生長的需要，5 天后可能由于小球藻濃度增加和對CO2需求量的增加從而導致生長速率有所減緩。而采用更高的CO2通入量時可能因通入的CO2過多從而對小球藻的生長具有一定的抑制作用;采用遞增通氣方式時隨著小球藻濃度的增加，CO2的通入量也增加，從而能為小球藻生長提供充足的碳源，因此培養(yǎng)效果也較理想。

圖3 CO2 通氣方式對小球藻生長的影響

2.4 分批補料培養(yǎng)對小球藻生長的影響

不同分批補料培養(yǎng)方式對小球藻生長的影響見表2。由表2 可知，當尿素和KH2PO4的起始添加量為總量的50%時，獲得最大的生物量為0.709 g/L，分批培養(yǎng)時的生物量最低，僅為0.557 g/L。這說明起始添加的氮和磷濃度過高從而抑制小球藻的生長，通過流加培養(yǎng)可消除氮和磷起始濃度高所引起的抑制作用，使小球藻不斷吸收充足營養(yǎng)而旺盛生長，從而取得更高的生物量。

2.5 不同培養(yǎng)基更新率對小球藻生長的影響

為了得到較穩(wěn)定的連續(xù)培養(yǎng)體系，本文研究了不同更新率下小球藻的生長情況，具體見表3 和圖4。

從圖4 可以看出，當更新率為10%和20%時，在培養(yǎng)初期就能夠維持在較高的生物量，隨著培養(yǎng)時間的延長生物量略微有下降。當更新率高于20%時，在培養(yǎng)的前幾天生物量持續(xù)下降，直到第5 天開始才維持穩(wěn)定，而且生物量明顯比更新率為10%和20%的低。由表3 可以看出，生物量隨著更新率的增加而減小，產(chǎn)率也隨著更新率的增大而減小，總采收量隨著更新率的增加而增加。結(jié)果與徐志標等［13］半連續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)綠色巴夫藻所得結(jié)果不一致，這可能是由于 藻種和培養(yǎng)條件不一樣造成的。

表2 分批補料培養(yǎng)對小球藻生長的影響

表3 不同更新率對小球藻生長的影響

圖4 不同更新率對小球藻生長的影響

2.6 冰醋酸對小球藻生長的影響

當藻類利用CO2作為其唯一碳源時。只能依賴光能作為全部的能量來源進行生物物質(zhì)的合成;而當光照成為限制因子時，微藻生長即變得緩慢。如果微藻能以有機物作為碳源，有機物亦同時充當了能量提供者的角色，藻類則可以在無光的條件下進行同化作用;微藻既利用光能，同時又利用有機物作為能源的光能異養(yǎng)(混合營養(yǎng))的同化作用方式將有利于提高其生長率。其中醋酸作為小分子酸類物質(zhì)，既可以調(diào)節(jié)微藻培養(yǎng)液的pH 值，也可以作為碳源被微藻利用，對微藻的生長可以具有雙重作用。冰醋酸對小球藻生長的影響見圖5。

由圖5a 可看出，一次性添加5、50、100 和125 μL/L 冰醋酸能不同程度地促進小球藻生長，并在100 μL/L 時最為顯著并獲得最高生物量和產(chǎn)率，分別為0.723 g/L 和0.088 g/(L·d)。由圖5b 可以看出，以流加方式添加冰醋酸比一次性添加冰醋酸對小球藻的生長更有利，以15、20、25 μL/(L·d)時均能獲得較好效果，尤其是25 μL/(L·d)時獲得0.933 g/L 的生物量，產(chǎn)率也達到0.111 g/(L·d)，分別是空氣對照組的1.3 倍和1.4 倍。在本實驗中微量冰醋酸的促生長作用更多的是由于冰醋酸對碳源和能量的補充作用，微量冰醋酸所起的pH 值調(diào)節(jié)作用是有限的。這與朱明［14］等一次性添加10 ～100 mg/L醋酸都可促進海鏈藻生長，每日1 次添加5 ～60 mg/L 的醋酸時，可明顯提高海鏈藻生長率的結(jié)果相一致。

圖5 冰醋酸對小球藻生長的影響

3 討論

目前大部分研究煙道氣CO2濃度在10% ～20%，并且煤炭燃燒排放的煙道氣含有NOX和SOX，其中SO2、NOx等對微藻都具有明顯毒害作用［15］。SOx、NOx等酸性氣體通過對pH 的影響而對微藻生長有顯著影響，SO2是SOx中主要污染成分，溶于水后以HSO3-、SO32-形式存在，SO32-可降低植物的光合作用，增加其氧化損傷，降低葉綠素含量，使植物葉片出現(xiàn)脫綠漂白現(xiàn)象［16］。岳麗宏［17］等的研究表明，當SO2體積濃度大于50 μL/L 時，需要進行煙氣脫硫或控制培養(yǎng)液pH 值變化來消除其影響;煙氣中NOX的體積濃度不高于300 μL/L 時，不影響小球藻的生長及其對CO2的固定，可作為氮源供小球藻生長。而本文利用甲醇廠排放的尾氣CO2，其CO2含量高達99.13%，并且不含有NOX和SOX，這就不用擔憂NOX和SOX對小球藻生長的負面影響，同時也省去了煙氣除硫的步驟，因此是一種更為理想的尾氣。Matsudo［8］等的研究表明，螺旋藻在管狀光生物反應器中利用尿素做氮源，同時以酒精發(fā)酵車間產(chǎn)生的CO2為碳源培養(yǎng)時獲得的最大生物量為(2.661 ±0.071)g/ L，最大細胞生產(chǎn)率0.839 g/(L·d)。Borkenstein［6］等的研究表明，利用水泥廠產(chǎn)生的廢氣培養(yǎng)蛋白核小球藻時獲得2.00 g/L 生物量和0.13 d-1的平均生長速率。岳麗宏［18］等的研究表明，當CO2濃度為10%，小球藻的生長率最高，CO2固定率平均值為0.397%。本文利用甲醇廠尾氣培養(yǎng)小球藻獲得最高生物量0.933 g/L 和產(chǎn)率0.111 g/(L·d)。由此可以看出，利用甲醇廠高濃度CO2尾氣進行微藻培養(yǎng)是可行的。

De Morais［19］等的研究表明，采用15 min/h 的方式通入高濃度CO2氣體時小球藻、柵藻和螺旋藻生長良好，小球藻的最大生物量為1.31 g/L。本文的結(jié)果也表明，采用間歇通入高濃度CO2的方式能夠促進小球藻的生長。岳麗宏［20］等的研究表明，在CO2濃度漸增的條件下比固定CO2濃度條件下小球藻對CO2固定速率高。本研究采用CO2濃度固定但是通氣時間漸增的通氣方式，對小球藻生長的促進作用沒有通氣時間固定的方式下明顯，這可能是通氣時間太長導致通入的CO2過多從而導致pH 值下降太多以至于對小球藻產(chǎn)生抑制作用。

采用流加技術(shù)可以使流加培養(yǎng)基中的氮、磷濃度維持在較低起始濃度，從而使藻體生長的延遲期縮短，延長小球藻對數(shù)生長期;同時，在藻的培養(yǎng)過程中采用流加技術(shù)可消除或緩沖藻體生長中代謝產(chǎn)物引起的培養(yǎng)液老化［21］，維持藻體的高生長速率，獲得高的藻體生物量。在半連續(xù)培養(yǎng)過程中，由于定時采用新鮮培養(yǎng)液替代等量的原培養(yǎng)液，使培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分增加，生物密度下降，透光率增加，因此，藻體光合效率增強，生長速率增快，有利于藻細胞保持良好的生長狀態(tài)［22］。本文中所得20%更新率可使小球藻生物量維持在較高的水平。

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