脊柱結(jié)核植入內(nèi)固定安全性的體外實(shí)驗(yàn)研究

矢慶明，殷 明，顧玉榮，吳 凱，吳 慶

（南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨一科，南昌 330006）

脊柱結(jié)核又稱為Pott’s病，Percival Pott在1877年首次報(bào)道由結(jié)核菌引起脊柱后凸畸形伴有截癱的脊柱疾患。近年來(lái)，隨著HIV感染者數(shù)量增加結(jié)核發(fā)病率明顯增高[1]。大多數(shù)脊柱結(jié)核呈隱匿性起病，從癥狀出現(xiàn)到臨床確診平均需11.2個(gè)月[2]，患者往往在神經(jīng)壓迫癥狀出現(xiàn)后數(shù)周、數(shù)月因癥狀加重甚至出現(xiàn)癱瘓才就醫(yī)，通過(guò)前路病灶清除可以對(duì)病灶處的膿液、死骨等壞死組織及結(jié)核桿菌作直接最有效的清除，術(shù)中為重建脊柱穩(wěn)定性及矯正術(shù)前畸形往往需要植入內(nèi)固定材料及自體骨，盡管術(shù)中通過(guò)沖洗等方式對(duì)結(jié)核桿菌進(jìn)行了有效地清除，但結(jié)核桿菌仍不可避免的在病灶內(nèi)有殘留。以往研究早已證明，引起生物材料相關(guān)感染的初始動(dòng)因就是細(xì)菌對(duì)生物材料的黏附[3]。生物材料的細(xì)菌黏附是指細(xì)菌與生物材料表面發(fā)生的特異性結(jié)合，對(duì)機(jī)體及材料的黏附幾乎是所有細(xì)菌所具有的普遍性能[4]。細(xì)菌表面的菌毛、肽聚糖、有黏附功能的莢膜、細(xì)胞外黏質(zhì)（Extracellar Slime Substance,ESS）、脂壁酸等稱為黏附素（A dhesin）,是黏附過(guò)程中的配體，生物材料表面與黏附素結(jié)合的位點(diǎn)叫受體，黏附就是受體與配體的特異性結(jié)合[4]。細(xì)菌對(duì)生物材料黏附后形成的包繞材料表面的生物膜可以避免細(xì)菌被機(jī)體吞噬細(xì)胞及抗生素殺滅，而且會(huì)不斷向組織、血液中釋放細(xì)菌形成慢性感染源，造成術(shù)后感染遷延不愈或復(fù)發(fā)。所以通過(guò)觀察結(jié)核桿菌對(duì)材料的黏附情況能對(duì)術(shù)中植入內(nèi)固定材料的安全性評(píng)估提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。筆者通過(guò)在體外模擬脊柱結(jié)核患者病灶清除植骨內(nèi)固定術(shù)后體內(nèi)環(huán)境，將3種不同材料的內(nèi)固定分別與結(jié)核桿菌及表皮葡萄球菌共同培養(yǎng)，并通過(guò)掃描電鏡觀察，比較不同細(xì)菌對(duì)不同材料的黏附情況，并探討脊柱結(jié)核病灶清除后植入內(nèi)固定的安全性問(wèn)題，為臨床選擇合理術(shù)式及安全的內(nèi)植物材料提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

不銹鋼 316L、鈦合金 Ti6AL4V、純鈦 CPTi，（山東威高骨科材料有限公司提供）。將材料切割加工成直徑6.0 mm、厚度2.0 mm的圓片，其表面粗糙度和臨床產(chǎn)品保持一致。每種材料制備48片，經(jīng)蒸餾水洗滌，高壓蒸汽滅菌后保持無(wú)菌備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株

結(jié)核分枝桿菌 （mycobacterium tuberculosis，MTB）標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv，江西省胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科提供；表皮葡萄球菌（staphylococcus epidermidis，SE）標(biāo)準(zhǔn)株NCCPBP26115，南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)菌液的制備

將結(jié)核桿菌接種于Middlebrook7H12液體培養(yǎng)基（購(gòu)自美國(guó)Bacton-Dickinsn公司）中37℃恒溫培養(yǎng)4周，表皮葡萄球菌接種于常規(guī)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 d，分別離心收集細(xì)菌，生理鹽水洗滌，再將結(jié)核桿菌注入Middlebrook 7H12液體培養(yǎng)基中制成濃度為108 CFU·m L－1懸液備用，將表皮葡萄球菌注入常規(guī)肉湯培養(yǎng)基中制成濃度為108 CFU/ml懸液備用。

1.4 細(xì)菌培養(yǎng)及黏附

將上述材料各取4片分別置入結(jié)核桿菌及表皮葡萄球菌菌液中37℃恒溫共同培養(yǎng)。在結(jié)核桿菌與材料共同培養(yǎng)的過(guò)程中，每5 d各取出材料1片；在表皮葡萄球菌與材料共同培養(yǎng)的過(guò)程中，每4 h各取出材料1片。此實(shí)驗(yàn)步驟重復(fù)進(jìn)行6次。

1.5 材料表面細(xì)菌黏附情況的電鏡觀測(cè)

將取出材料用生理鹽水洗滌3遍去除表面的培養(yǎng)液及未黏附的細(xì)菌，然后置入2.5%戊二醛中固定4 h，再分別用70%、80%、90%、95%的乙醇逐級(jí)脫水，室溫下自然干燥，在掃描電鏡（S-3000N，HITACHI）下觀測(cè)各材料表面的細(xì)菌黏附情況。在每片材料上隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)算黏附細(xì)菌總數(shù)并求出每視野內(nèi)細(xì)菌數(shù)均值，以時(shí)間為變量繪制細(xì)菌黏附曲線圖。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以細(xì)菌種類分類、材料性質(zhì)分類作為分組變量，取黏附曲線圖中各材料黏附不同細(xì)菌數(shù)量最高值為觀測(cè)指標(biāo)，對(duì)表1所示統(tǒng)計(jì)資料行兩因素析因設(shè)計(jì)定量資料方差分析，采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 以時(shí)間為變量的細(xì)菌黏附曲線圖

根據(jù)圖1、2發(fā)現(xiàn)，結(jié)核桿菌黏附數(shù)量開(kāi)始隨時(shí)間推移逐步增多，到培養(yǎng)第10 d到達(dá)高峰并基本維持穩(wěn)定，黏附數(shù)量有少許波動(dòng)；表皮葡萄球菌在培養(yǎng)4 h第1次取出材料檢測(cè)時(shí)黏附數(shù)量即在高峰值，而后3次黏附數(shù)量稍有下降。

圖1 結(jié)核桿菌對(duì)不同材料的黏附動(dòng)態(tài)曲線

圖2 表皮葡萄球菌對(duì)不同材料的黏附動(dòng)態(tài)曲線

2.2 結(jié)核桿菌和表皮葡萄球菌對(duì)同種材料黏附的對(duì)比

根據(jù)表1可以發(fā)現(xiàn)在不銹鋼、鈦及鈦合金材料上，表皮葡萄球菌的黏附數(shù)量都明顯高于結(jié)核桿菌的黏附數(shù)量，隨后的表2方差分析結(jié)果提示2種細(xì)菌對(duì)同種材料的黏附差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 不同材料上的結(jié)核桿菌黏附比較

根據(jù)表1可以發(fā)現(xiàn)在不銹鋼材料上結(jié)核桿菌的黏附數(shù)量要高于鈦及鈦合金材料上的結(jié)核桿菌的黏附數(shù)量，隨后的表2方差分析結(jié)果也提示結(jié)核桿菌對(duì)不銹鋼材料的黏附量與其對(duì)其他2種材料的黏附量之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 2種細(xì)菌在不同材料表面黏附最高數(shù)量均值±s，n=6，個(gè)·視野－1

表1 2種細(xì)菌在不同材料表面黏附最高數(shù)量均值±s，n=6，個(gè)·視野－1

材料 結(jié)核桿菌 表皮葡萄球菌不銹鋼 9.78±0.884 132.56±6.40純鈦 6.52±1.22 78.65±10.84鈦合金 5.81±0.91 89.51±11.33

表2 統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

3 討論

在前言中已經(jīng)提到，細(xì)菌對(duì)生物材料的黏附是引起生物材料相關(guān)感染的初始動(dòng)因，既往研究表明，細(xì)菌對(duì)材料的黏附是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，而且與細(xì)菌的生長(zhǎng)關(guān)系密切[5]。所以本次實(shí)驗(yàn)中將結(jié)核桿菌和內(nèi)固定材料一起培養(yǎng)動(dòng)態(tài)觀察細(xì)菌的黏附情況。筆者選擇生物材料相關(guān)感染中常見(jiàn)的致病菌表皮葡萄球菌作為本次實(shí)驗(yàn)的對(duì)照細(xì)菌，實(shí)驗(yàn)中將培養(yǎng)和取材觀察步驟重復(fù)進(jìn)行6次以減少隨機(jī)誤差。不同細(xì)菌在培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)傳代周期不同，表皮葡萄球菌和臨床常見(jiàn)細(xì)菌一樣，生長(zhǎng)速度快，一般20min就可繁殖一代；而結(jié)核桿菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)需求高，生長(zhǎng)較慢，一般需14~18 h繁殖一代[6]。在實(shí)驗(yàn)中根據(jù)細(xì)菌生長(zhǎng)的速度分不同時(shí)段4次取出材料觀察表面的細(xì)菌黏附情況，繪制出動(dòng)態(tài)黏附曲線圖，結(jié)果證實(shí)兩種細(xì)菌對(duì)材料的黏附均是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，因本次實(shí)驗(yàn)未進(jìn)行細(xì)菌的傳代測(cè)定，所以均取4個(gè)時(shí)段中黏附數(shù)量最高1次的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，可以較為準(zhǔn)確地反映細(xì)菌對(duì)材料的最大黏附能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在3種材料上表皮葡萄球菌的黏附數(shù)量均明顯高于結(jié)核桿菌，也就是說(shuō)明結(jié)核桿菌對(duì)生物材料的黏附能力明顯弱于臨床常見(jiàn)致病菌表皮葡萄球菌，不易導(dǎo)致以內(nèi)固定材料為中心的結(jié)核慢性感染或感染復(fù)發(fā)。探討其原因仍考慮結(jié)核桿菌作為特異性感染的菌源，一方面可能因其對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境營(yíng)養(yǎng)要求高、生長(zhǎng)速度緩慢、生物學(xué)活性相對(duì)較弱；另一方面和該細(xì)菌缺乏菌毛、鞭毛、莢膜以及分泌的ESS等黏附素，難以形成細(xì)菌表面的黏附配體和包繞內(nèi)固定材料表面的生物膜有重要相關(guān)。

近年來(lái)隨著醫(yī)用材料學(xué)的發(fā)展，骨科內(nèi)固定材料的研制更新也是日新月異。本次實(shí)驗(yàn)采用了臨床最常用的內(nèi)固定材料不銹鋼、鈦及鈦合金，而且材料表面粗糙度和臨床使用產(chǎn)品保持一致，所以實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)臨床內(nèi)固定材料的選擇更具指導(dǎo)意義。材料表面的化學(xué)組成、臨界表面張力、界面能、表面親水、疏水性、表面電荷等對(duì)細(xì)菌的黏附均有較大影響，所以不同材料即使對(duì)同種細(xì)菌的黏附力也是有差別的[4]。在本次實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌對(duì)3種不同材料的黏附數(shù)量存在差別，在本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析表明在體外結(jié)核桿菌對(duì)不銹鋼材料的黏附力明顯強(qiáng)于鈦和鈦合金材料，而對(duì)后兩種材料的黏附力沒(méi)有顯著的差別。通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)研究，認(rèn)為脊柱結(jié)核患者行病灶清除植骨內(nèi)固定的術(shù)式是合理安全的，不易誘發(fā)術(shù)后結(jié)核感染遷延不愈或復(fù)發(fā)，在內(nèi)固定材料的選擇上，筆者推薦使用鈦或者鈦合金材料。

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