促甲狀腺素受體基因D727E多態(tài)性與甲狀腺相關(guān)性眼病的相關(guān)性研究

尹曉艷 閆春芳 孫斌

甲狀腺相關(guān)性眼病（thyroid-associated ophthalmopathy,TAO）是一種與多種因素相關(guān)的常見(jiàn)的眼眶疾病[1]，是以眼球后及眶周組織的浸潤(rùn)性病變?yōu)樘卣鞯淖陨砻庖咝约膊?是引起成人眼球突出的最常見(jiàn)原因。近些年來(lái)，許多國(guó)內(nèi)外的專(zhuān)家學(xué)者對(duì)TAO進(jìn)行了研究，在發(fā)病機(jī)制和診斷方法上，取得了一定的進(jìn)展，但是由于樣本大小、研究人群以及地域的不同,各研究結(jié)論不同。目前普遍認(rèn)為是遺傳因素、免疫學(xué)因素及外界環(huán)境共同作用產(chǎn)生。國(guó)內(nèi)外研究表明,基因的多態(tài)性可能與TAO的發(fā)病有關(guān)。由于TAO常伴隨GD發(fā)生，很多患者血清促甲狀腺素受體抗體（anti-thyrotropin receptor antibody,TRAb）含量增高[2]，因此促甲狀腺素受體（TSHR）成為T(mén)AO自身抗原的研究首選。然而，TSHR與TAO的作用機(jī)制還不是很明確。目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)TAO和TSHR多態(tài)性關(guān)系的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究旨在探討TSHR基因與TAO的關(guān)系，并采用PCR-RFLP方法研究TSHR基因D727E多態(tài)性與TAO的關(guān)系，為T(mén)AO的預(yù)防及治療提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 TAO組：51例，男20例，女31例；年齡9～65歲，平均（39.98±14.84）歲。病程1月～19年，平均（1.69±3.19）年，樣本均來(lái)自山西醫(yī)科大學(xué)第一及第三醫(yī)院眼科確診的患者，納入標(biāo)準(zhǔn)為1979年美國(guó)甲狀腺協(xié)會(huì)(American Thyroid Association,ATA)制定的診斷及分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[3]，患者均經(jīng)甲狀腺功能測(cè)定、眼部B超或CT檢查排除了其他疾病所導(dǎo)致的突眼,并且有專(zhuān)人測(cè)量其雙眼突出度[4]；GD組：55例，男24例，女31例;年齡13～78歲，平均（34.33±9.501）歲。病程1月～11年，平均（2.83±4.21）年，納入標(biāo)準(zhǔn)為《內(nèi)科學(xué)》第7版Graves病[5]。CON組：60例，男24例，女36例，年齡12～76歲，平均（41.67±10.36）歲，為山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院健康體檢中心篩選的無(wú)自身免疫性及感染性疾病的健康人群，年齡、性別與病例組相匹配。所有患者及健康對(duì)照者均為山西地區(qū)漢族人，并簽署了知情同意書(shū)。

1.2 臨床檢查 一般檢查：包括詳細(xì)詢(xún)問(wèn)病史及全身體檢。

眼部常規(guī)檢查：包括視力、外眼、屈光系統(tǒng)、眼底和眼球運(yùn)動(dòng)。眼球突出度檢查采用Hertel突眼計(jì)檢查。根據(jù)我國(guó)正常人眼球突出度標(biāo)準(zhǔn)：雙眼球或單眼球突出度>14mm，或雙眼球突出度相差≥2mm者，為眼球突出（除外生理性或假性突出）。用復(fù)視圖檢查分析眼外肌功能。部分患者行眼眶CT、B超檢查，分析眼外肌、視神經(jīng)及眶內(nèi)病變狀況，以協(xié)助診斷。

1.3 TSHR D727E多態(tài)性研究方法 （1）基因提取 抽取空腹靜脈血2ml，EDTA-K2抗凝，用飽和酚-氯仿三步法提取外周血DNA。（2）引物合成 引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。上游引物：5’-CCATTCCTCTATGCTATTTTCAC-3’；下游引物：5’-CCGTTTGCATATACTCTTCTG-3’[6]。（3）PCR擴(kuò)增反應(yīng) 反應(yīng)體系40ul，由8ul基因組DNA，4ul 10×Buffer，0.8ul 10×dNTP，3.2ul 25mmol/L MgCl2，0.06ul上游引物，0.06ul下游引物，0.32ulTaq酶，24ul去離子水組成。循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，61.6℃退火45s，72℃延伸45s，循環(huán)35次，72℃終末延伸10 min。目的基因片段長(zhǎng)度為265bp。（4）酶切：擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶NlaⅢ酶切后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，在紫外透射儀下觀(guān)察條帶。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用Hardy-Weinberg平衡法則檢驗(yàn)樣本的群體代表性。用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析各組等位基因和基因型頻率，組間比較用χ2檢驗(yàn)，顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)а=0.05。

2 結(jié)果

2.1 TSHR D727E位點(diǎn)酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果 TSHR D727E位點(diǎn)野生型（CC）片段為160bp、84bp和21bp 3個(gè)片段；純合變異型（GG）片段為181bp和84bp 2個(gè)片段；雜合變異型（GC）片段為181bp、160bp、21bp和84bp 4個(gè)片段，如圖1。

圖1 TSHR D727E位點(diǎn)酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果。M:marker;4、5、6、7野生型CC;3純合變異型GG;1、2、8、9雜合變異型GC。

2.2 TSHR D727E位點(diǎn)等位基因頻率與基因型的分布 G等位基因頻率：TAO組（28.4%）GD組（15.5%）CON組（5.8%），χ2=21.020，а=0.000<0.05，表明G等位基因頻率三組之間有差異。兩兩比較，TAO組與GD組，χ2=5.246，а=0.022<0.05；TAO組與CON組，χ2=20.723，а=0.000<0.05；GD組與CON組，χ2=5.684，а=0.017<0.05。表明此三組兩兩之間G等位基因頻率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TAO組G等位基因頻率（28.4%）明顯高于GD組（15.5%）及正常對(duì)照組（5.8%）；GD組G等位基因頻率（15.5%）明顯高于正常對(duì)照組（5.8%）。

GG+GC基因型頻率：TAO組(47.1%)GD組(25.5%)CON組(10.0%)，χ2=19.482，а=0.000<0.05，表明GG+GC基因型頻率三組之間有差異。兩兩比較，TAO組與GD組，χ2=5.371，а=0.020<0.05；TAO組與CON組，χ2=19.196，а=0.000<0.05；GD組與CON組，χ2=4.771，а=0.029<0.05。表明此三組兩兩之間GG+GC基因型頻率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TAO組GG+GC基因型頻率（47.1%）明顯高于GD組(25.5%)及正常對(duì)照組（10.0%）；GD組GG+GC基因型頻率(25.5%)明顯高于正常對(duì)照組（10.0%），如表1。

表1 TSHR D727E基因型及等位基因頻率分布

3 討論

TSHR是一種跨膜性蛋白，屬于G蛋白偶聯(lián)受體，體內(nèi)主要分布在甲狀腺濾泡細(xì)胞膜上[7]。研究表明TSHR是許多自身免疫性甲狀腺疾病(auto immune thyrod disease,AITD)主要的自身抗原之一。在生理狀態(tài)下，促甲狀腺素(TSH)通過(guò)TSHR而影響甲狀腺細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和功能的發(fā)揮。病理狀況下，TSHR又是TRAb攻擊的靶，是引起甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)(甲亢)的自身抗原[8]。TSHR的主要功能為與TSH結(jié)合，通過(guò)腺苷酸環(huán)化酶- cAMP途徑發(fā)揮生理作用。若編碼TSHR的序列發(fā)生了變異，可引起TSHR蛋白結(jié)構(gòu)和免疫源性改變，導(dǎo)致自身抗體產(chǎn)生，包括針對(duì)甲狀腺刺激性(TSAb)或阻斷性(TBAb)等抗體。在GD時(shí),TSAb可抑制Fas在TEC的表達(dá),從而抑制Fas/FasL引起的TEC凋亡,參與GD甲狀腺腫的形成[9]。但TBAb的產(chǎn)生是否與TSHR基因突變有關(guān)的問(wèn)題頗有爭(zhēng)議,仍需要進(jìn)一步的研究[10]。

編碼人TSHR的基因位于14號(hào)染色體長(zhǎng)臂(14q13)，全長(zhǎng)超過(guò)60kb，約含58000堿基對(duì)，有10個(gè)外顯子，9個(gè)內(nèi)含子。第1至第9外顯子編碼TSHR的細(xì)胞外功能區(qū)，而跨膜區(qū)及細(xì)胞內(nèi)區(qū)則由單個(gè)巨大的始基型第10個(gè)外顯子編碼[11]。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)TSHR基因上膜內(nèi)區(qū)的D727E(Asp-Glu)的改變與GD相關(guān)，但各家報(bào)道的結(jié)論相去甚遠(yuǎn)。目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)TAO和TSHR多態(tài)性關(guān)系的文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究以TSHR為候選基因，采用PCR-RFLP方法探討TSHR基因D727E多態(tài)性與山西地區(qū)部分漢族人TAO易感性的關(guān)系。其結(jié)果顯示：G等位基因頻率及GG+GC基因型頻率三組之間有差異，此三組兩兩之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TAO組G等位基因頻率及GG+GC基因型頻率明顯高于GD組及正常對(duì)照組；GD組G等位基因頻率及GG+GC基因型頻率明顯高于正常對(duì)照組。表明TSHR基因D727E位點(diǎn)的G等位基因與TAO及GD的發(fā)生相關(guān)。由此，從基因?qū)W的角度我們支持TSHR是甲狀腺和眼眶受累組織共同抗原的學(xué)說(shuō)。此結(jié)果與梁軍等人研究結(jié)論不一致[12]，他們認(rèn)為漢族人TSHR受體基因與GD無(wú)相關(guān)性。

目前不同研究中存在的許多不一致現(xiàn)象，可能是由于遺傳易感因素的異質(zhì)性造成的。通過(guò)對(duì)不同群體的基因型-表現(xiàn)型相關(guān)性分析，可揭示遺傳異質(zhì)性在疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用。因此有很多的問(wèn)題尚需我們進(jìn)一步探討、研究和改進(jìn)。

[1]Terwee CB,Dekker FW,Mourits MP,et al.Interpretation and validity of changes in scores on the Graves’ophthalmopathy quality of life questionnaire after different treatment[J].Clin Endo,2001,54(3):391-398.

[2]孫斌，李重文，宋補(bǔ)昌，等.Graves病與Graves眼病的FT3、FT4、STSH、TGAb、TMAb、TRAb檢測(cè)及臨床意義[J].中國(guó)實(shí)用眼科雜志,2005,23(5):537-539.

[3]李風(fēng)鳴.眼科全書(shū)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1996:1232-1233.

[4]原惠萍.眼科測(cè)量的正常值[A]//惠延年.眼科學(xué)[M].6版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2004:278-280.

[5]陸再英，鐘南山.內(nèi)科學(xué)[M].7版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2008:717-718.

[6]Chou HT,Shi YR,Chang CT,et a1.The Polymorphisms ofCodon 727 and 52 of Thyroid-Stimulating Hormone Receptor Gene arc not Associated with Mitml Valve Prolapse Syndrome in Taiwan Chinese[J].Jpn Heart J,2002,43(6)：655-666.

[7]Rocchi R.Clinical utility of autoantibodies directed against TSHR[J].Medical Laboratory Observer,2005,37(4):10-11,14-15,16-17.

[8]Burman KD,Baker JR.Immune mechanisms in Graves’disease[J].Endocr Rev,1985,6(2):183-232.

[9]Abe Y.A poptosis in the pathogenesis of autoimmune thyroid disease[J].N ippon R insho,1999,57(5):1717-1722.

[10]楊蘭，曾建業(yè)，李山.Graves病相關(guān)易感因素的研究進(jìn)展［J］.內(nèi)科，2009,4（1）：78-80。

[11]何劍峰，吳中耀，楊華勝，等.TSHr在Graves眼病患者眼眶脂肪細(xì)胞中的表達(dá)[J].中國(guó)實(shí)用眼科雜志,2005,23(11):1173-1175.

[12]梁軍,高聆,盛燕，等.TSHR基因上新發(fā)現(xiàn)SNP及其在GD致病中的評(píng)價(jià)[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2007,36（5）：30-33.