基于SSR分子標記的栽培種茄子遺傳多樣性分析

孫源文陳鈺輝劉富中張映連勇

（農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

茄子（Solanum melongenaL.）在世界各地廣泛栽培，我國是世界第一茄子生產(chǎn)大國（FAO，2009）。我國作為茄子的栽培馴化起源地之一（Daunay et al.，2001），茄子品種類型繁多，種質(zhì)資源十分豐富。茄子不同品種資源在開展度、株高、花冠色澤、果皮顏色、果形、單果質(zhì)量等農(nóng)藝性狀方面存在差異，而且不同性狀在不同材料之間表現(xiàn)出不同程度的多樣性（詹園鳳 等，2007；趙德新 等，2009；文林宏 等，2010；梁任繁 等，2011）。

關于茄子種質(zhì)資源遺傳多態(tài)性已有應用AFLP（廖毅 等，2009）、RAPD（冉進 等，2007；王秋錦 等，2007；陳杰 等，2008）、SRAP（房超 等，2011；李懷志 等，2011）及ISSR（毛偉海 等，2006）等分子標記技術分析的相關報道，基本認為茄子的遺傳基礎相對較狹窄。然而，由于各自的取材、標記技術及分析方法不同，對資源材料的分類及其與地理來源的相關性存在很大的爭議。

SSR（simple sequence repeat）是建立在PCR 技術上的一種廣泛應用的分子標記，具有含量豐富、多態(tài)性高、共顯性等優(yōu)點。因其DNA樣本用量少、技術操作簡便、重復性和穩(wěn)定性好，在番茄（宋建 等，2006）、辣椒（羅玉娣 等，2006）、玉米（肖木輯 等，2006；母貴琴 等，2011）、黃瓜（穆生奇，2008）、馬鈴薯（段艷鳳 等，2009）、甘薯（趙冬蘭 等，2011）、水稻（楊文毅 等，2011）等作物遺傳多態(tài)性分析及遺傳連鎖圖譜構建等方面的研究中廣泛應用。本試驗利用SSR分子標記對34份商品果實性狀差異明顯、具有代表性和地理來源不同的栽培種茄子高代自交系進行遺傳多樣性分析，希望為茄子分子標記輔助育種提供進一步的理論依據(jù)和實踐參考。

表1 34份供試茄子材料農(nóng)藝性狀和來源

1 材料與方法

1.1 材料

試驗以34份經(jīng)多年自交選育的農(nóng)藝性狀遺傳穩(wěn)定、地理來源不同的栽培種茄子高代自交系為供試材料（表1）。

茄子SSR引物序列參照Nunome等（2009）的引物，選取基本覆蓋茄子12條染色體的105對引物，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 果實性狀調(diào)查 34份供試材料于 2010年春季統(tǒng)一種植于中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所廊坊試驗基地溫室，每個材料種植 2行，每行6株，田間管理按常規(guī)方法統(tǒng)一進行。按照《茄子種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》（李錫香，2006）的記載標準，對供試材料果實性狀（果形、果皮色、果萼色）進行調(diào)查。

1.2.2 DNA提取 苗期取新鮮葉片5～10 g，利用改良CTAB法提取DNA。1.5 mL離心管中加入一片新葉（約0.2 g）液氮速凍研磨至細粉末，加700 μL CTAB在65 ℃水浴1 h；加入700 μL氯仿/異戊醇（24V∶1V）搖晃均勻，4 ℃ 12000 r·min-1離心10 min；吸上清液500～600 μL，加入800 μL預冷的無水乙醇輕輕顛倒混勻，4 ℃靜置抱團；倒去乙醇，加入800 μL 75%乙醇清洗兩遍；50 ℃烘箱干燥1 h，加入100 μL雙蒸水緩沖液，充分溶解DNA沉淀后加入 2 μL RNaseA（10 mg·mL-1），37 ℃溫浴 10 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴增及標記檢測 總反應體系10 μL：模板DNA 100 ng（1μL），引物共0.6 μL，Green Master Mix 5 μL，ddH2O 3.4 μL。

擴增條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，34個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。

擴增產(chǎn)物采用JY-JX5雙垂直電泳槽（186 cm×95 cm），在非變性聚丙烯酰胺凝膠（20%）和0.5×TBE緩沖溶液條件下電泳分離。AgNO3染色、觀察、拍照，統(tǒng)計條帶。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

1.3.1 果實性狀聚類分析 果實表型性狀數(shù)據(jù)標準化處理：果皮色中紫紅記為0，黑紫記為1；果形中圓形（包括圓球形、高圓形、扁圓形）記為0，筒形（包括長筒形、短筒形）記為1；果萼色中綠色記為0，紫色記為1；產(chǎn)地來源國外記為0，國內(nèi)記為1。

統(tǒng)計數(shù)據(jù)按 UPGMA（unweight pair group method using arithmetic averages）方法，采用NTSYS-pc version2.10e軟件進行聚類分析。

1.3.2 SSR標記聚類分析 SSR擴增產(chǎn)物以0、1、9統(tǒng)計建立數(shù)據(jù)庫：在相同遷移率位置上，有帶記為1，無帶記為0，缺失記為9，根據(jù)不同分析軟件的格式要求做相應的轉(zhuǎn)換（肖木輯 等，2006）。

按UPGMA方法，采用NTSYS-pc version2.10e軟件進行聚類，獲得樹狀圖；群體內(nèi)某一位點的等位變異數(shù)和有效等位基因數(shù)、Shannon’s信息指數(shù)統(tǒng)計等用Popgene軟件進行分析計算（任小平 等，2010）；每個SSR位點的多態(tài)性信息量（Polymorphism information content，PIC）按公式PIC=1-∑fi2計算，其中fi為i位點的基因頻率（趙永鋒 等，2011）。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標記檢測結(jié)果

本試驗利用已公布的105對茄子SSR引物，對34份茄子供試材料基因組DNA進行PCR擴增反應和凝膠電泳檢測，其中79對SSR引物在34份材料中共擴增出307個序列片段，譜帶在100～800 bp之間（圖1）。79對SSR引物中最少的可擴增出1條譜帶，最多的可擴增出12條譜帶，平均每對引物擴增出4.55條譜帶，也說明這79對SSR引物能夠用于本試驗茄子材料的遺傳多樣性分析。

圖1 引物SSR022擴增結(jié)果

2.2 多態(tài)性信息分析

通過Popgene軟件對篩選出的79對SSR引物所建數(shù)據(jù)庫進行分析，結(jié)果顯示其中47對具有效多態(tài)性信息含量，共有148個多態(tài)性位點，位點多態(tài)性達到80.87%，有效等位變異所占比重為77.13%。這47對引物共含有214個等位基因（表2），等位基因的平均值約為4.55個，變幅2～12個。其中含有等位基因數(shù)最多是SSR003，共有12個等位基因，其次是SSR022和SSR001，為10個，SSR015為9個，SSR014和SSR139為8個；但有效等位基因（Ne）的平均值約為3.50個，變幅為1.0261～11.0295，其中SSR003、SSR022、SSR139含有的有效等位基因最多；每個標記的多態(tài)性信息含量（PIC）的平均值為 0.582800，變幅為 0.025436～0.909334，最高為SSR003，其次為SSR022、SSR139、SSR014；標記的基因型多樣性指數(shù)（H）平均值為0.9898，變幅為0.0310～2.2034，SSR003和SSR022最高；Shannon’s信息指數(shù)（I）的平均值為1.2795，變幅為0.0810～3.1563。

標記的多態(tài)性信息含量（PIC）值基本與等位基因變異數(shù)目相對應，即等位基因變異較多的SSR引物一般都具有較高的多態(tài)性信息含量（PIC）值；本試驗中 PIC＞0.5的引物有32對，0.25＜PIC＜0.5的引物有9對；PIC＜0.25的引物有6對。由以上數(shù)據(jù)分析可知，本試驗聚類分析中遺傳多態(tài)性較高的引物僅占全部的約30%，合適引物較少，多態(tài)性位點不足，可能無法將材料完全區(qū)分，也說明供試材料遺傳多態(tài)性不高，遺傳背景較狹窄。

2.3 聚類分析

2.3.1 基于果實表型性狀的聚類分析 從果實表型性狀聚類樹狀圖（圖2）可知，供試材料遺傳相似系數(shù)在0.30～0.75之間，平均值為 0.52。在遺傳相似系數(shù) 0.30處材料可分為兩個大類群，即Ⅰ圓茄包括20份材料，Ⅱ長茄包括 14份材料，符合率達到100%；在遺傳相似系數(shù)0.375處，圓茄類群分為a，b兩個組群，a為果皮黑紫色組群，b為果皮紫紅色組群；長茄類群分為 c，d兩個組群，c是果皮黑紫色組群，d是果皮紫紅色組群。每個組群在遺傳相似系數(shù)0.508處都可劃分為2個小群，圓果形、果皮黑紫色、萼片紫色的國內(nèi)材料主要集中在a-1群中，長茄則分布在 c-1、c-2和 d-2群中。樹狀圖表明根據(jù)果實表型性狀能將供試材料進行粗略分類。

2.3.2 基于SSR標記的聚類分析 依據(jù)79對SSR引物的條帶信息建立數(shù)據(jù)庫，由 NTSYS-pc version2.10e軟件進行聚類，獲得樹狀圖。由聚類樹狀圖（圖3）可以看出，供試材料遺傳相似系數(shù)在0.63～0.93之間，供試材料之間的遺傳差異不大，遺傳基礎相對狹窄。在遺傳相似系數(shù)為0.63時，34份茄子材料可以分為兩大類群。第I類群包括15份材?料，果實形狀為圓形、果皮黑紫色、萼片紫色，來源于河北、天津、山西及河南；第Ⅱ類群包含19份材料，果實形狀多為筒形。第Ⅱ類群材料在遺傳相似系數(shù)0.75處可以分為Ⅱ-1和Ⅱ-2兩個小組，Ⅱ-1小組包括6份供試材料，遺傳相似系數(shù)變幅為0.75～0.85，果實形狀為高圓或筒形，果皮紫紅色，萼片多數(shù)為紫色，主要是來自國內(nèi)的材料；Ⅱ-2小組包括 13份材料，遺傳相似系數(shù)變幅為 0.79～0.93，果實形狀從高圓到長筒均有，果皮黑紫色，萼片紫或綠色，全部來源于國外?；赟SR標記的聚類分析結(jié)果顯示，利用SSR標記能將供試材料進行詳細分類，材料主要依果形歸類，與地理來源有一定的相關。

表2 34份茄子材料的SSR標記的等位基因數(shù)、有效等位基因和遺傳多樣性指數(shù)

圖2 34份茄子材料基于果實表型性狀聚類分析圖

圖3 34份茄子材料基于SSR分子標記聚類分析圖

3 結(jié)論與討論

本試驗通過對105個SSR標記進行篩選，得到79個多態(tài)性標記，但只有47個標記在供試材料中具有多態(tài)性信息含量，且利用此47個標記構建的樹狀圖與79個標記構建的樹狀圖基本相同，逐漸增多標記，樹狀圖基本不再發(fā)生變化，此結(jié)果說明，豐富有效的SSR標記是將試驗材料區(qū)分開的基礎，構建茄子遺傳圖譜，對特定性狀進行定位，有助于區(qū)分不同茄子品種。

供試材料遺傳相似系數(shù)在0.63～0.93之間，平均值0.78，說明多數(shù)材料間具有一定的遺傳差異，但總體供試材料遺傳基礎相對比較狹窄，這與毛偉海等（2006）、冉進等（2007）用其他標記分析茄子材料遺傳多樣性結(jié)果相似。進一步說明育種中常用的茄子高代自交系的遺傳相似性很高，遺傳基礎非常狹窄，也說明茄子品種選育的親本材料非常有限。因此，在茄子育種中廣泛收集和創(chuàng)造新的種質(zhì)資源，積極引進國外優(yōu)異種質(zhì)資源，挖掘優(yōu)良基因，擴大我國茄子育種的種質(zhì)資源基因庫，對提高我國茄子育種有重要意義。

基于分子標記或農(nóng)藝性狀聚類分析栽培種茄子分類的有許多報道，本試驗中供試材料依據(jù)SSR標記和果實表型性狀的聚類分析可將供試材料分為兩大類，即圓茄和長茄，這與傳統(tǒng)的Bailey（1929）和 Hara（1944）的茄子分類系統(tǒng)基本吻合。從二者樹狀圖對比可知，基于 SSR標記的聚類分析較基于果實表型性狀的聚類分析，劃分得更詳細，能更準確地反映種質(zhì)的遺傳基礎。從本試驗聚類結(jié)果看，基本可以按照果實農(nóng)藝性狀和來源大體進行歸類，這可能與本試驗供試材料的選擇有關，材料主要來自北方地區(qū)及國外引進栽培種的茄子高代材料，來源地較為集中且果實性狀和顏色變異較少。少數(shù)高圓果形材料（5、6、9、19、20號）被歸類到Ⅱ類群長茄大類群，原因可能是沒有篩選到合適的引物，導致這幾份材料無法分開。本試驗部分供試材料為國外引種，但其與我國材料的遺傳相似性較高，這可能與地區(qū)、國家之間的種質(zhì)交流頻繁導致品種間遺傳相似性增高有關；其次可能是利用分子標記多態(tài)性數(shù)據(jù)進行遺傳多樣性分析，必須要有足夠的多態(tài)性位點，且這些位點能夠盡量均勻覆蓋整個基因組，而針對本試驗標記位點分析結(jié)果表明，其未能均勻覆蓋整個基因組。因此進一步開發(fā)篩選多態(tài)性信息量較高的 SSR分子標記，構建茄子遺傳連鎖圖譜，對分子標記技術在茄子育種中的應用更具實際意義。

本試驗利用SSR標記從分子水平上分析了茄子高代材料的親緣關系，可以根據(jù)本結(jié)果在保證達到育種目標的前提下，在育種時選用不同類群的自交系配制組合，避免育種過程中出現(xiàn)遺傳背景狹窄、變異度降低等問題，進而可以減少親本選擇、選配的盲目性，大大提高育種效率。

陳杰，李懷志，莊天明，陳火英．2008．茄子栽培種與野生種種質(zhì)資源遺傳關系的RAPD分析．上海交通大學學報：農(nóng)業(yè)科學版，（2）：165-167．

段艷鳳，劉杰，卞春松，段紹光，徐建飛，金黎平．2009．中國 88個馬鈴薯審定品種 SSR指紋圖譜構建與遺傳多樣性分析．作物學報，35（8）：1451-1457．

房超，李躍建，帥波，劉獨臣，劉小俊，梁根云，楊宏．2011．茄子及其近緣野生種遺傳多樣性的SRAP 分析．西南農(nóng)業(yè)學報，24（5）：1853-1860．

李懷志，張峻，李翔，陳火英．2011．應用SRAP 標記對茄子品種進行遺傳多樣性分析與指紋圖譜構建．南京農(nóng)業(yè)大學學報，34（4）：18-22．

李錫香．2006．茄子種植資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社．

梁任繁，王益奎，李文嘉，黎炎，吳永官．2011．茄子主要栽培種遺傳多樣性分析．西南農(nóng)業(yè)學報，24（5）：1861-1866．

廖毅，孫保娟，黎振興，羅少波，陳日遠，孫光聞，李植良．2009．茄子及其近緣野生種遺傳多樣性及親緣關系的 AFLP分析．熱帶作物學報，30（6）：781-786．

羅玉娣，李建國，李明芳．2006．用SSR標記分析辣椒屬種質(zhì)資源的遺傳多樣性．生物技術通報，（s）：337-341．

毛偉海，杜黎明，包崇來，胡天華，朱琴妹，胡海嬌．2006．我國南方長茄種質(zhì)資源的ISSR標記分析．園藝學報，33（5）：1109-1112．母貴琴，潘旭浩，楊克誠．2011．不同類型玉米種質(zhì)群體的SSR遺傳多樣性分析．西南農(nóng)業(yè)學報，24（2）：418-421．

穆生奇．2008．SSR技術在黃瓜遺傳多樣性及雜種純度鑒定上的應用〔碩士論文〕．北京：中國農(nóng)業(yè)科學院．

冉進，宋明，房超，文明玲，劉小俊，劉獨臣，李躍建．2007．茄子（S. melongenaL．）種質(zhì)資源遺傳多樣性的RAPD分析．西南農(nóng)業(yè)學報，20（4）：694-697．

任小平，張曉杰，廖伯壽，雷永，黃家權，陳玉寧，姜慧芳．2010．ICRISAT花生微核心種質(zhì)資源SSR標記遺傳多樣性分析．中國農(nóng)業(yè)科學，43（14）：2848-2858．

宋建，陳杰，陳火英．2006．利用SSR分子標記分析番茄的遺傳多樣性．上海交通大學學報：農(nóng)業(yè)科學版，24（6）：524-528．

王秋錦，高杰，孫清鵬，楊愛珍，趙福寬．2007．茄子品種遺傳多樣性的RAPD檢測與聚類分析．植物生理學通訊，43（6）：1035-1039．文林宏，李桂蓮，王爾學．2010．茄子種質(zhì)資源主要性狀的調(diào)查及評價．中國園藝文摘，（12）：72-74．

肖木輯，李明順，孫有位，李新海，張世煌．2006．遼寧省主要玉米自交系的SSR遺傳多樣性分析．玉米科學，14（1）：33-36．

楊文毅，嚴紅梅，董超，張恩來，阿新祥，湯翠鳳，楊雅云，張斐斐，和建平，徐福榮．2011．不同地理來源水稻品種的SSR分子標記遺傳相似性分析．中國農(nóng)學通報，27（12）：24-30．

詹園鳳，黨選民，袁建民，張秀明．2007．茄子種質(zhì)資源形態(tài)性狀的多樣性分析．安徽農(nóng)學通報，13（18）：78-79．

趙德新，孫治強，任子君，胡文超．2009．茄子形態(tài)學性狀主成分分析及聚類分析．河南農(nóng)業(yè)大學學報，43（4）：393-397．

趙冬蘭，鄭立濤，唐君，周志林，曹清河．2011．甘薯種質(zhì)資源遺傳穩(wěn)定性及遺傳多樣性SSR分析．植物遺傳資源學報，12（3）：389-395．趙永鋒，韓美玲，黃亞群．2011．基于SSR分子標記的玉米自交系遺傳多樣性分析．中國農(nóng)學通報，27（9）：111-115．

Daunay M C，Lester R N，Ano G．2001．Cultivated eggplants in tropical plant breeding．Oxford：Oxford University Press：200-225．

Hara H．1944．Taxonomical studies on useful plants in Japan． The Miscellaneous Report of the Research Institute for Natural Resources，7：63-73．

Nunome T，Negoro S，Kono I，Kanamori H，Miyatake K，Yamaguchi H，Ohyama A，F(xiàn)ukuoka H．2009．Development of SSR markers derived from SSR-enriched genomic library of eggplant（Solanum melongenaL.）．Theory Appl Genet，119（6）：1143-1153．